实验器材清洗包装消毒韩鹏

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,实验器材清洗包装消毒韩鹏,细胞培养常用实验器材,一、玻璃器材,培养瓶,滴流瓶,刻读吸管、离心管等,培养皿,烧杯、量筒等,三角烧瓶,二、塑料器材,多孔培养板,培养皿,培养瓶,离心管,针头式加压塑料小滤器,三、橡皮器材,橡皮制品,(,最好是硅制品,),主要是各种瓶或试管的塞子、盖子。,四、金属器材,剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头等,五、其他物品,纱布,注射器和针头,原理,清洗与消毒是细胞培养实验的第一步，是细胞培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明、无油迹，而且不能残留任何物质。如果有毒的化学物质，哪怕残留微克，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。,实验目的,能独立的进行用于细胞培养的各种器皿的清洗、包装与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和过滤除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。,一、实验器材的清洗,(一)操作方法,1. 清洗液（酸液）的配制方法,2. 物品的清洗,(1). 新购置物品玻璃器皿清洗步骤,(2).,使用过的玻璃器皿清洗步骤,(3). 橡皮制品的清洗,(4). 塑料制品的清洗,(5). 金属制品的清洗,(二)清洗注意事项和要求,(一)操作方法,1. 清洁液（酸液）的配制方法,常用的清洗液是硫酸-重铬酸钾溶液。可根据需要配制不同的强度。,配制方法,：,（1）将重铬酸钾放入大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。,（2）将重铬酸钾液倒入酸缸中，然后缓慢加入硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分混合溶解。,操作时务必注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液渐到皮肤和衣物上。万一不慎渐到皮肤上应立即用大量清水冲洗。,2. 物品的清洗,(1) 新购置物品玻璃器皿清洗步骤,清水浸泡半小时以上简单刷洗5%的稀盐酸浸泡过夜自来水冲洗在洗涤剂中反复刷洗自来水中充分冲洗凉干（或50烤干）浸入清洁液中（俗称泡酸）过夜流水振荡冲洗20遍漓水去离子水冲洗34次或浸泡2次（每次24小时）三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）50烤干，待包装。,(2) 使用过的玻璃器皿清洗步骤,毒玻璃器材用后应立即浸入消毒水中，非带毒的玻璃器材需浸入清水中浸泡刷洗自来水冲洗凉干（50烤干）,浸入清洁液中（俗称浸酸）不低于6小时或过夜流水振荡冲洗20遍漓水去离子水冲洗34次或浸泡2次（每次24小时）三蒸水冲洗两次（或浸泡一次）50烤干，待包装。,注意：, 步骤中：a. 用洗涤液（中性），最好不用洗衣粉（碱性）；,b.毛刷刷洗，每个角落20下,(3) 橡皮制品的清洗,新购置的橡胶制品（大小胶塞、橡皮胶头）的洗涤方法如下：,2%NaOH煮沸15分钟流水冲洗25%稀HCl煮沸15分钟流水冲洗去离子水煮沸20分钟（或去离子水浸泡过夜）去离子水冲洗一次三蒸水煮沸20分钟三蒸水冲洗一次50烤干备用,旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。,(4) 塑料制品（不耐强酸、不耐热）,用后立即用流水冲洗浸于自来水中过夜用纱布或棉签沾洗涤剂刷洗流水冲洗晾干浸于清洁液（次强酸液）中浸泡2-6h流水冲洗20遍蒸馏水冲洗3次或浸泡24小时晾干（浸泡在75%酒精中备用临用前从75%酒精中取出）在超净台内紫外线照射1h左右方可使用。也可在洗净后不经70%乙醇浸泡，而用塑料袋包好，成箱地去照射60Co灭菌。,注射器薄膜滤器刷洗前先将上、下两部分分开，按上述方法清洗晾干后将纤维薄膜滤片夹在中间（光面向下）拧紧上下两部分，备用。,(5) 金属制品的清洗,不锈钢除菌滤器的清洗,先用洗涤剂刷洗滤器流水冲洗去离子水冲洗23次（去离子水浸泡24小时）三蒸水冲洗23次或浸泡24小时干燥。,镊子、剪刀、手术刀、解剖刀（刀片）（专用、不混用）等的清洗,纱布擦去脏污自来水洗净酒精棉球擦试。,注：新的,金属器材的消毒处理方法-纸擦去表面的油脂-洗衣粉煮沸，或用,1%,碳酸氢钠煮沸,15,分钟-水洗-,95%,酒精纱布擦干-包装灭菌,(二)清洗注意事项和要求,1. 使用后的实验器材应立即投入清水中。带毒的玻璃器皿需先浸泡在5来苏儿或1盐酸溶液中（依病毒的种类而定）1天以上或高压灭菌。,2. 浸泡、煮沸、酸泡的器皿内要充满液体，不得有气泡。,3. 煮沸前的水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗涤剂；若洗涤剂和实验器材同时从冷水煮至沸腾或使用过量洗剂均易腐蚀玻璃表面，使玻璃碱化pH值上升。,4. 软毛刷的刷端已掉毛的应该弃去，否则会损害玻璃。玻璃划痕处易残留洗涤剂,会改变培养液瓶pH和毒害细胞。,(二)清洗注意事项和要求,5. 浸泡器材的蒸馏水容器要专用，并做好标记，如“蒸馏水1盆”、”蒸馏水2盆。,6. 器材清洗干燥后，在以后各步操作时，手指不可接触器材的使用端。清洗者可戴一次性薄膜手套进行操作，这样省时又保证清洗质量。,7. 清洁物品应及时包装消毒，应注意妥善保存，防止落入灰尘、蟑螂、蚂蚁等引起二次污染。,8. 刷洗、酸泡后的器材要用流水振荡冲洗；不得残留洗涤剂、清洁液。,二、实验器材的包装和灭菌,(一) 包装,1. 包装时手指与器材接触面积要小，手指不能触及器材的使用端。,2. 瓶类：需用局部包扎，用牛皮纸或锡箔纸包扎瓶口。随后单个或几个一起用纸包好。,3. 玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端、抽滤瓶下口端等）加脱脂棉，随后吸管、滴管置吸管筒（内放纱布），盖上有孔盖子（内外孔对好），外包上两层牛皮纸，若没有吸管筒应每根吸管单独包扎。,4. 带盖的瓶子或塑料离心管等物品应拧松盖子，包装消毒后再拧紧。,5. 为防止已消毒品和未消毒品发生混淆，应在包装盒或包装纸的表面做好标记，注以符号或写上字“” “”。,消毒(disinfection)和消毒剂(disinfectant),消毒,是指杀死病原微生物、但不一定能杀死细菌芽孢的方法。通常用化学的方法来达到消毒的作用。,用于消毒的化学药物叫做,消毒剂,。,灭菌(sterilization),灭菌,是指把物体上所有的微生物（包括细菌芽孢在内）全部杀死的方法，通常用物理方法来达到灭菌的目的。,防腐(antisepsis)和防腐剂,防腐,是指防止或抑制微生物生长繁殖的方法。,用于防腐的化学药物叫做,防腐剂,。,抑菌(bacteriostasis)和抑菌剂(bacteriostatic),抑菌,是指抑制细菌生长繁殖的方法。,抑菌剂,是能抑制细菌生长的物质，但其可能无法杀死细菌。常用的抑菌剂是一些抗生素，能可逆性抑制细菌的繁殖，但不直接杀死细菌。,无菌(asepsis),无菌,不含活菌的意思，是灭菌的结果。,无菌技术/无菌操作(antiseptic technique),防止微生物进入机体或物体的操作技术称为,无菌操作,。,一些概念,实验用品,洗净并烘干好的相应实验器材、脱脂棉、纱布、高压蒸汽灭菌锅、牛皮纸或锡箔纸，线绳、塞脱脂棉用的针头或牙签、记号笔。,消毒与灭菌,1、物理消毒法,（1）射线消毒灭菌：主要使用60Co、X射线进行消毒灭菌，可用于牛血清和塑料制品的灭菌。,（2）紫外线消毒：用于消毒空气、操作台面和一些不能用于干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。,消毒方法 使用紫外灯。消毒的效能和距离成反比，因此应根据消毒的目的适当设置消毒距离：进行空气消毒是灯管应距地面以内；台面的消毒应在80cm以内；培养器皿的消毒在30cm以内。,消毒时间与效能存在一定的关系，但不是绝对的：照射20min后，有71%的细菌被消灭；40min后79%的细菌被消灭；60min后86%的细菌被消灭。紫外线照射时间再长也不是100%的灭菌，最多只能把90%的细菌消灭，过长的照射是没有意义的。故单独使用时，一般只用于空气和台面的消毒。如仅用紫外线照射带菌的器皿，则无法彻底灭菌，所以应与其他消毒方法结合使用，如先用75%的酒精浸泡，再照紫外线消毒灭菌等。,检查消毒灭菌效果 照射后为检查超净台是否达到无菌效果，可在已照射的洁净台四角和酒精灯旁分别放置5个含琼脂糖半固定体培养基的直径90mm培养皿，20min后再转入37度培养箱中培养72h，观察细菌生长情况。如果每块平皿上无菌落生长，说明洁净台符合无菌标准。,（3）干热灭菌,主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放入干燥箱内，加热至160度，保持2h。,电热恒温鼓风干燥箱,主要用于烘干和玻璃器皿的消毒，干热消毒（160, 2小时）,（4）湿热灭菌,此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品（如胶塞）、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液（如Hanks液、PBS等）。,手动高压灭菌锅操作如下：,首先查看高压锅内的水是否充足，放入物品盖好盖。,加热高压锅。将放气阀打开，放气5-10min，以排除锅内的冷空气。,待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅（121度）30min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅（115度）20min。调节火力大小保持该压力。,停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖取出高压灭菌的物品烘干。,高压蒸汽灭菌器,全自动手提式灭菌器,（5）过滤除菌,用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器（直径90mm、100mm、142mm.等），配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器（直径20mm、25mm等）。滤膜孔径有微米、微米、微米、微米、微米等，以微米除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。,在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为微米。,用布包好，湿热灭菌后使用。,2、化学消毒法,常用的消毒液有如下几种：,（1）70%或75%酒精：超净台里常备70%酒精（卫生级酒精），用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。,（2）0.1%新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备有0.1%新洁尔灭溶液的容器及纱布。,（3）来苏儿水（煤酚皂溶液）：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。,（4）0.5%过氧乙酸：是强效消毒剂，10min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦试方式进行。,（5）乳酸蒸气：将乳酸放入坩埚内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1-3d。可将空气中漂浮的微生物杀死。,（6）37%甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37%甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放入已加热好的甲醛中形成蒸气。1-3d后方可达到消毒空气的目的。,3、煮沸消毒,急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15min后使用。,注意事项,1.清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10-15次。因为残存的洗液对细胞黏附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。,2.干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度100时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。,3.高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。,注意事项,4.牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压灭菌。,5. 过滤除菌时，滤器在使用前先装好滤膜，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。,6.使用化学消毒法时，配制75%酒精应用卫生级，不需要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。,动物细胞培养实验器材的准备,无菌操作室的灭菌与消毒,培养器材的清洗和消毒,无菌衣、帽和口罩等的灭菌,培养基的过滤除菌,凡是检验中使用的器材，能灭菌处理的必须灭菌处理。如玻璃器皿、注射器、吸管、缓冲盐溶液、无菌服、口罩等 ，在使用前都必须经过各种适宜的方法灭菌，在适宜的储存器或较洁净的环境中保存备用。凡无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。例如：无菌室内的凳、试管架、天平、工作台、容器或包装以及工作人员的手等，这些虽无法进行灭菌，但可以消毒。无菌间使用的拖鞋也要定期消毒处理。,实验报告,1.填表1各种瓶皿的清洗步骤，并根据教师安排进行清洗。,3.填表2消毒和灭菌处理方法。,表1. 各种瓶皿的清洗,表2.,消毒和灭菌处理方法,思考题,1.哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。,2.紫外线消毒的适用范围和目的是什么？,Thank You !,不尽之处，恳请指正！,