血清清球蛋白分离新生物学

单击此处编辑母版标题样式,编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,2013,年秋季学期,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2013,年秋季学期,*,单击此处编辑母版标题样式,生物化学与分子生物学实验教学中心,大家好,1,2013,年秋季学期,生物化学与分子生物学实验教学中心,血清清蛋白、,g,-,球蛋白的分离、提纯与鉴定,2,3,内 容,实验目的,1,实验原理,2,实验材料,3,实验过程,4,5,注意事项,4,实验目的,掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法,掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法,掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法,掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法,了解柱层析技术,实验分组,四个人一小组,6,实验过程,盐析（粗分离）,葡聚糖凝胶层析（脱盐）,DEAE纤维素离子交换层析（纯化）,醋酸纤维素薄膜电泳（纯度鉴定）,7,实验材料,人混合血清,葡聚糖凝胶（G-25)层析柱,DEAE纤维离子交换层析柱,饱和硫酸铵溶液,醋酸铵缓冲溶液,20%磺基水杨酸,1%BaCl,2,溶液,氨基黑染色液,漂洗液,pH8.6巴比妥缓冲溶液,电泳仪、电泳槽,8,实验原理,蛋白质的,分离和纯化,是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。,不同蛋白质的,分子量,、,溶解度,及,等电点,等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。,9,蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法,10,血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量,清蛋白,A,11,1. 粗提（盐析法）,由于血清中各种蛋白质分子的,颗粒大小、所带电荷的多少,和,亲水程度,不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。,调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。,血清清蛋白,球蛋白,半饱和硫酸铵,清蛋白不沉淀，上清,球蛋白沉淀，蒸馏水溶解,盐析法,盐析法是在蛋白质溶液中，加入无机盐至一定浓度或达饱和状态，可使蛋白质在水中溶解度降低，从而分离出来。,水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化膜减弱乃至消失。,蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，蛋白质分子之间聚集而沉淀。,13,2. 脱盐（凝胶层析）,盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐，必须先脱盐后才能进一步纯化。,脱盐有多种方法，本实验采用,凝胶层析法。,凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质,分子大小的不同,而将其分离的技术。,凝胶层析分离示意图,15,凝胶层析分离化合物示意图,16,3.纯化（离子交换层析）,离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换，利用化合物的,电荷性质,及,电荷量不同,进行分离,R-SO,3,-,H,+,+ Pr,+,R-SO,3,-,Pr,+,+ H,+,阳离子交换,阴离子交换,R-N,+,R,3,OH,-,+ Pr,-,R-N,+,R,3,Pr,-,+ OH,-,17,血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量,清蛋白,A,0.06mol/LNH,4,AcpH6.5,DEAE,带正电荷,清蛋白,pI 4.9,，带,负电荷多,a,、,b,球蛋白,pI 5.0,5.2,，,带,负电荷少,a,、,b,球蛋白被洗脱,清蛋白仍被吸附,0.02mol/LNH,4,AcpH6.5,DEAE,带正电荷,清蛋白及,a,、,b,球蛋白的,pI,6.5,，带,负电荷,g,球蛋白,pI,6.5,，,带,正电荷,清蛋白及,a,、,b,球蛋白被层析柱吸附,g,-,球蛋白被洗脱,0.3mol/LNH,4,Ac pH6.5,DEAE,带正电荷,缓冲液离子强度增加,清蛋白被洗脱,19,20,4.纯度鉴定（电泳）,血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳结果,21,血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量,清蛋白,A,22,醋酸纤维素薄膜电泳原理,血清中各种蛋白质的等电点不同，一般都低于pH7.4。它们在pH8.6的缓冲液中均解离带负电荷，在电场中向正极移动。由于血清中各种蛋白质分子大小、形状及所带的电荷量不同，因而在醋酸纤维素薄膜上电泳的速度也不同。因此可以将它们分离为清蛋白（Albumin)、,1,-球蛋白、,2,-球蛋白、-球蛋白、-球蛋白5条区带。,23,醋酸纤维素薄膜电泳,1. 点样(粗面),8cm,2cm,点样线,点样区,1.5cm,(,粗面）,点样线,尽量点得细窄而均匀,宁少勿多,小组标记,样品标记,24,2. 电泳,薄膜粗面向下,点样端置阴极端,两端紧贴在滤纸盐桥上，,膜应轻轻拉平,注意：,切勿使点样处与电泳槽接触,电压：,110V,时间：,50min,。,25,3. 染色和漂洗,电泳完毕后，关闭电源，将膜取出，直接浸于染色液中5min。,取出膜，尽量沥净染色液，移入漂洗液中浸洗脱色（一般更换2次），至背景颜色脱净为止。,取出膜，用滤纸吸干即可。,用,1ml 0.02mol/L NH,4,AC,缓冲液清洗层析柱内壁,继续用,0.02mol/L pH6.5 NH,4,AC,缓冲液洗脱，流出液量约,1ml,时开始检测蛋白质,取血清,0.8ml,，,边摇边缓慢滴加,饱和硫酸铵溶液,0.8ml,，混匀室温放置,10min,，,4000r/min,离心,10min,沉淀（含球蛋白）加水,0.6ml,溶解,上清液（含清蛋白、少量,球蛋白和,球蛋白,),用,1ml 0.02mol/L NH,4,AC,缓冲液清洗层析柱内壁,继续用,0.02mol/L pH6.5 NH,4,AC,缓冲液,(2ml),洗脱，流出液量约,1ml,时开始检测蛋白质,凝 胶 柱 层 析 除 盐,磺基水杨酸检测蛋白质,收集含有蛋白质的峰液,12d,此时磺基水杨酸和,BaCl,2,检测可能同时阳性,继续用,2ml 0.02mol/L NH,4,AC,缓冲液洗涤,BaCl,2,检测,SO,4,2-,阴性,用,23ml 0.02mol/L NH,4,AC,缓冲液再生平衡,过葡聚糖凝胶,G-25,层析柱（,1.07cm,）,过葡聚糖凝胶,G-25,层析柱（,1.07cm,）,磺基水杨酸检测蛋白质,收集含有蛋白质的峰液,12d,此时磺基水杨酸和,BaCl,2,检测可能同时阳性,继续用,2ml 0.02mol/L NH,4,AC,缓冲液洗涤,BaCl,2,检测,SO,4,2-,阴性,用,23ml 0.02mol/L NH,4,AC,缓冲液再生平衡,盐析,操作流程,离子交换柱层析纯化,加样,加样,用,1ml 0.0,mol/L NH,4,AC,缓冲液清洗层析柱内壁,用约,mL 0.06mol/L NH,4,AC,缓冲液流洗，除去,球蛋白和,球蛋白,离 子 交 换 柱 层 纯 化,除盐后收集的清蛋白,用,1ml 0.02mol/L NH,4,AC,缓冲液清洗层析柱内壁,继续用,0.02mol/L pH6.5 NH,4,AC,缓冲液,(3ml),洗脱，流出液量约,1ml,开始检测蛋白质,取浓度最高的,1,管作纯度鉴定（醋酸纤维素薄膜电泳法）,磺基水杨酸检测蛋白质,收集含有蛋白质的洗脱液每管,10d,，连续收集,3,管,DEAE-,纤维素柱不用再生，可直接用于纯化清蛋白,除盐后收集的球蛋白,过,DEAE-,纤维素层析柱（,1.06cm,）,过,DEAE-,纤维素层析柱（,1.06cm,）,用,0.3mol/L NH,4,AC,缓冲液,(,约,3ml),洗脱，流出液量约,2ml,开始检测蛋白质,磺基水杨酸检测蛋白质,收集含有清蛋白的洗脱液每管,10d,，连续收集,2,管,DEAE-,纤维素柱先用,6ml l.5mol/L NaCl - 0.3mol/L NH,4,AC,溶液流洗，再用,10ml 0.02mol/L NH,4,AC,缓冲液流洗再生平衡,离子交换柱再生和蛋白纯度鉴定,2,管均作纯度鉴定,(,醋酸纤维素薄膜电泳法,),28,注意事项,所用血清应新鲜，无沉淀物及细菌滋生。,使用时勿将各时段所应用的溶液浓度弄错。,上样时，滴管应沿柱上端内壁加入样品，动作应轻、慢，勿将柱床冲起。流洗平衡时亦应如此。,洗脱时应注意及时收集样品，切勿使蛋白质峰溶液流失，并,注意层析柱不要流干，进入空气,。,切勿将检测蛋白质的磺基水杨酸与检查SO,4,2-,的BaCl,2,混淆，因二者与相应物质生成的沉淀均为白色。,葡聚糖凝胶价钱昂贵，要回收再生,避免损耗，严禁倒掉!,29,思考题,1.硫酸铵盐析一步,为什么是0.8ml血清加0.8ml饱和硫酸铵?,2.为什么实验中DEAE纤维素柱分离-球蛋白后不用再生,可直接用于纯化清蛋白?,3.应用醋酸纤维素薄膜电泳鉴定分离纯化后的血清清蛋白和-球蛋白的纯度,根据什么来确定它是清蛋白还是-球蛋白?判定它们纯度的依据是什么?,南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学中心,Thank You !,30,2009,年秋季学期,31,实验预期结果,-,+,血清,清蛋白第,1,管,清蛋白第,2,管,-,球蛋白管,点,样,线,A,-,1,2,