细胞培养技术进阶教程

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞培养技术进阶,细胞培养技术,1,、细胞原代培养,2,、细胞生长状况的观察,3,、细胞传代,4,、细胞冻存、复苏和运输,5,、细胞活力检测,6,、细胞周期检测,7,、细胞凋亡检测,8,、细胞凋亡的流式分析,1,、细胞原代培养,原代培养,也叫初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外进行的,首次培养,。,1,、取材,2,、漂洗,3,、剪切,4,、消化,5,、过滤,6,、清洗,7,、计数,8,、接种,2,、细胞生长状况的观察,培养细胞生长状况常规检查,1,、培养液：颜色与透明度的变化,2,、细胞生长状况。,3,、细胞形态变化。,4,、微生物污染。,1,、培养液,PH,值,（颜色变化,）,变黄，表示,PH,值下降，细胞生长旺盛，代谢产生的酸性物不断积累导致。,变红或紫红色，表示,PH,值上升，细胞生长停滞、死亡。,一般生长稳定的细胞需要,2-3,天换液,1,次，生长慢的细胞需要,3-4,天换液一次。,原代细胞换液,通常每周两次，每次换半量或,1/5-1/3,量。原代细胞第,1,次换液时，切记不要把培养液全部倒掉。,(2),细胞系,(,株,),换液,:,条件合适时生长迅速，过夜就变黄，可进行全量换液。这种情况下，最好减少细胞接种数，延长换液的时间。,方法,:,2,、细胞形态变化：,生长良好细胞：透明度大，折光性强，轮廓不清。,生长状态不良时，细胞折光性变弱，轮廓增强，胞质中常出现空泡，脂滴，颗粒样物质，细胞之间空隙加大。,3,、微生物污染：,培养液颜色与透明度：,培养液混浊，液体内漂菌丝或细胞菌。,支原体污染，没有明显症状，但细胞生长却明显变缓。,细胞培养的污染和检测,细胞污染的种类,细菌、酵母菌、霉菌和病毒,污染源,无菌操作技术不当,操作室环境不佳,污染之血清,污染之细胞,细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。,洋葱佰克霍尔德菌（,Burkholderiacepacia,）原属假单胞菌属，是植物病原菌。,白色念珠菌污染,真菌感染,支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状,3,、细胞传代（贴壁细胞）,：,1.,吸光培养瓶中的培养液,2.,加入,0.5-2 ml 0.25,的胰蛋白酶液,(,以消化液能覆盖整个瓶底为准），然后两种方式处理：一种,30S,后，吸去消化液，剩余的酶液继续作用，后在相差显微镜下观察。第二种，不吸去消化液，静置,2-10 min,（显微镜下动态监测）。,在倒置镜下观察被消化的细胞，如果胞质回缩，细胞变圆，相互之间不再连接成片,.,3.,吸去胰蛋白酶液，加入含血清的培养液。,4.,用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液,(,按顺序,),。然后离心沉淀细胞。,5.,吸取,1:2-5,细胞悬液，接种于新的培养瓶内。,6.,加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。,7.,将后者放入培养箱中培养。,4,、细胞冻存、复苏和运输,冻存和复苏的原则：,慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内,形成冰晶。,如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,低温保护剂的应用,常用的低温保护剂是,DMSO,，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,1,、预先配制冻存液： 含,20%,血清培养基,10% DMSO,2,、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用吸管吹打制成细胞悬液（,110,6,5 10,6,细胞,/ml),3,、加入,1ml,细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名,称和冷冻日期。,冷冻保存要点：,冷冻过程要缓慢。,4 30,60,分钟,-20 30,分钟 ,-80 16,18,小时（或过夜）液氮长期保存,冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于,90,，无微生物污染。细胞浓度控制在：,1,10,7,5,10,7,/ml,。,细胞复苏方法,（,l,）从液氮中取出冷冻管，迅速投入,37,38 ,水浴中，使其融化（,1,分钟左右）。,（,2,）,5,分钟内用培养液稀释至原体积的,5-10,倍以上。,（,3,）低速离心,10,分钟。,（,4,）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,细胞运输：,（,1,）长距离运输（几天）,选择生长良好细胞，换细胞液，补充新培养液至瓶颈部，保留微量空气，拧紧瓶盖，,瓶子口用胶密封，并用棉花包，放在携带者贴身口袋带回，或用包装盒空运。,（,2,）短距离运输（几小时）,去掉大部分生长液，仅留少量液体覆盖单层细胞，防止细胞干燥，将细胞附着面朝上带回。,（,3,）液氮冻存运输,5,、细胞活力检测,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做,细胞活力,。,应用：由组织中分离细胞,复苏后的细胞,药物筛选,方法：,细胞计数,+,台盼兰染色,MTT,法,（,1,）细胞计数,将,血球计数板,及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。,将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。,静置,3,分钟。,镜下观察计数,细胞浓度的计算：,Volume,(,体积,),=,長,x,寬,x,深度,= 1 mm x 1 mm x 0.1 mm,= 0.1 mm3,= 1 x 10,-4,cm3 (ml),细胞密度,(,个,/mL),=,4,个大方格的细胞总数,/4,10,-4,=4,个大方格的细胞总数,/4,10,4,（,2,）台盼兰排斥染色,原理：死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见兰色的细胞，活细胞不被染色，呈透明状。,步骤：,制备单细胞悬液，并适当稀释（,10,5,/ml,）,9,滴细胞悬液,+1,滴,0.4%,台盼兰,染液，混匀染色。,吸取少许悬液涂于计数板上。,3,分钟内计数活细胞和死细胞,细胞数,/ml,（,4,大格细胞数之和,/ 4,）,10,4,稀释倍数细胞活力（）未着色细胞数,总细胞数,100,(3),四唑盐（,MTT,）比色法,四唑盐（,MTT,）：噻唑蓝,原理：,活细胞中,脱氢酶,能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。,二甲亚砜（,DMSO,）,能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色深浅与活细胞数成正比。,优点：,简单快速、灵敏、经济,应用,:,新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。,操作流程：,细胞接种,96,孔板（,200ul,，,10,3,-10,4,/,孔）,贴壁后加处理因素,加入,MTT 20 ul,（,5mg/ml,）,培养,4 h,酶标仪检测,0D,值（波长,490nm,）,吸出培养液，加入,DMSO150ul,摇床震荡,10 min,注意事项,选择,适当的细胞接种浓度,，保证细胞培养结束时浓度不至于过满,种板技术：,均匀,实验时应设置调零孔，溶媒孔，加药孔。,调零孔：培养基、,MTT,、,DMSO,。（无细胞）,溶媒孔：培养液、,MTT,、,DMSO,、细胞、溶酶,加药孔：培养液、,MTT,、,DMSO,、细胞、不同浓度的药物,（一般,5-7,个梯度，设,3-5,个复孔）,避免血清干扰：一般选小于,10%,胎牛血清的培养液进行。,边缘效应,：周边孔加入,PBS,6,、细胞周期检测,流式细胞术,PI,染色,细胞周期,:,细胞每一次分裂增殖的周期,流式细胞术,PI,染色检测细胞周期,原理：,碘化丙锭（,PI,）,可与细胞内,DNA,和,RNA,结合,采用,RNA,酶将,RNA,消化后,通过流式细胞术检测到的与,DNA,结合的,PI,的荧光强度直接,反映了细胞内,DNA,含量的多少,。,通过流式细胞术,PI,染色法对细胞内,DNA,含量进行检测时,可以区分细胞周期各时相：,G1/ G0,期具有二倍体细胞的,DNA,含量,G2/ M,期具有四倍体细胞的,DNA,含量,(4N),S,期的,DNA,含量介于二倍体和四倍体之间,应用：通过流式细胞仪分析,各时期的细胞百分数,，可检测细胞的增殖周期。,增加膜通透性,消化,RNA,7,、细胞凋亡的检测,凋亡形态学特征,细胞体积变小，胞质浓缩。,胞膜结构完整，有泡状突起。,核染色质浓缩，聚集核膜周围。,细胞膜内陷形成凋亡小体,(Apoptotic bodies),。,无内容物外溢，因而不引起周围的炎症反应。,形态学鉴定,细胞膜结构改变分析,胞膜通透性增加：,改变细胞对一些核染料物质（,DAPI,、,Hoechst,、,PI,）的通透性，利用着色结果的差异区别检测坏死和凋亡细胞,膜内侧磷脂酰丝氨酸（,PS,）外翻到膜表面：,Annexin V,法,常用方法有：,DAPI,、,Hoechst,、,PI,单染、,Heochst/PI,双染、,Annexin-V/PI,双染等。,DAPI,DAPI,是一种,可以穿透细胞膜,的蓝色荧光染料。,与,DNA,的结合是非嵌入式的，主要结合在,DNA,的,A-T,碱基区,Hoechst,染色,Hoechst,为,膜通透性,核酸染料，,DNA,结合型荧光染料,可以嵌合到碱基分子,能进入正常细胞，凋亡细胞的胞核会呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染,凋亡细胞,PI,（,Propidium Iodide,碘化丙啶,）,是一种常用的细胞核荧光染色剂。,它,不能透过完整的细胞膜,，但在,凋亡中晚期的细胞和死细胞,，,PI,能够透过细胞膜而,将细胞核染红,将,Annexin-V,、,Heochst,与,PI,匹配,使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来,Heochst/PI,双染,凋亡细胞膜通透性增高，,Hoechst,荧光（蓝色）强度增高,PI,不能进入细胞膜完整的活细胞中,：正常细胞和凋亡细胞拒染，坏死细胞由于失去膜完整性可染（红色）。,磷脂酰丝氨酸外翻分析（,Annexin V,法）,磷脂酰丝氨酸（,Phosphatidylserine, PS,）,在细胞凋亡的早期可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,Annexin-V,是一种,Ca2,依赖性磷脂结合蛋白，能与,PS,高亲和力特异性结合。,将,Annexin-V,进行荧光素（,FITC,）或,biotin,标记，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。,Annexin V/PI,双染色法,8,、细胞凋亡的流式分析,利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。,流式细胞术（,Flow Cytometry,，,FCM,）,:,流式细胞仪工作原理,经荧光染色的细胞从喷嘴中高速喷出，通过一个聚焦的光源进而通过各种光敏元件测量这些细胞发射的散射光和荧光，经计算机处理得到多种信息参数,信号检测,-,散射光,前散射光（,FSC),与细胞的大小有关,侧散射光,(SSC),反映细胞内的颗粒多少,信号检测,-,荧光信号,X,轴：代表荧光信号或散射光信号的强度，用,“,通道数,”,表示，与光强度之间线性关系或对数关系,Y,轴：代表该通道内所出现具有相同光信号特征性细胞的频率,流式细胞仪检测细胞凋亡常用的三种方法,（一）,PI,单染色法,（二）,Heochst 33342/PI,双染色法,（三）,Annexin V/PI,双染色法,PI,单染色法,Heochst 33342/PI,双染色法,凋亡细胞,膜通透性增高，,Hoechst 33342,荧光（蓝色）强度增高,PI,不能进入细胞膜完整的活细胞中：正常细胞和凋亡细胞拒染，,坏死细胞,由于膜完整性可染（红色）。,区别正常细胞、凋亡细胞和坏死细胞：,正常细胞：低蓝光,/,低红光,凋亡细胞：高蓝光,/,低红光,坏死细胞：高蓝光,/,高红光,Annexin V/PI,双染色法,Annexin V/PI,双染色法,左下象限,:,活细胞，为（,FITC-/PI-,）；,右上象限,:,坏死细胞（,FITC+/PI+,）,右下象限,:,凋亡细胞（,FITC+/PI-,）,细胞培养常见问题解答：,3,、为何培养基保存于,4,C,冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且,pH,值会越来越偏碱性？,培养基保存于,4,C,冰箱中， 培养基内之,CO2,会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂,(,通常为,phenol red),的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之,CO2,，以调整,pH,值。,4,、培养细胞生长减慢可能原因：,由于更换不同培养液或血清,比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验,增加起始培养细胞浓度,培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏,让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子,培养物中有少量细菌或真菌污染,用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。,试剂保存不当,血清需保存在,-5,到,-20,。培养液需在,2,8,避光保存。含血清完全培养液在,2-8,保存，并在,2,周内用完,5,、培养细胞不贴壁,胰蛋白酶消化过度,缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度,支原体污染,分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物,培养液中无贴壁因子,6,、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？,欲回收动物细胞，其离心速率一般为,300xg (,约,1,000rpm),，,5 - 10,分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡,7,、培养液,pH,值变化太快,CO2,张力不对,按培养液中,NaHCO3,浓度增加或减少培养箱内,CO2,浓度，,2.0g/L,到,3.7g/L,浓度,NaHCO3,对应,CO2,浓度为,5, 到,10,改用不依赖,CO2,培养液,培养瓶盖拧得太紧,松开瓶盖,1/4,圈,NaHCO3,缓冲系统缓冲力不足,加,HEPES,缓冲液至,10,到,25mM,终浓度,培养液中盐浓度不正确,在,CO2,培养环境中改用基于,Earles,盐制的培养液，在大气培养环境中培养改用,Hanks,盐配制的培养液,细菌、酵母或真菌污染,丢弃培养物或用抗生素除菌,8,、培养液出现沉淀，但,pH,值不变,用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来,用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌,冰冻保存培养液,将培养液加热到,37,，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液,9,、培养液出现沉淀，同时,pH,发生变化,细菌或真菌污染,丢弃培养物,抗生素除菌,10,、原代细胞培养物污染,原代培养组织在进入培养前已污染,培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织,11,、支原体,(mycoplasma),污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？,不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。,如有支原体污染，直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。,