08酶工程制药 -酶工程制药

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 酶工程制药,第一节 酶工程概论,第二节 药用酶的来源和生产,第三节 固定化酶工程,第四节 酶工程应用实例,第五节 酶工程研究进展,第一节 酶工程概论,一、酶的定义和分类,二、酶的特性,三、酶的来源,四、酶的生产菌种,五、产酶菌株的制备和优化,一、酶的定义和分类,酶的定义-酶是生物体内具有特殊催化功能的蛋白质。,酶的分类-分为6大类1、氧化-复原酶2、转移酶3、水解酶4、裂合酶5、异构酶6、连接酶合成酶,二、酶的特性,1、专一性强,2、催化效率高,3、反响条件温和,4、酶活性的调控机制复杂,醛糖复原酶的活性中心,三、酶的来源,一来源类别,二利用微生物生产酶制剂的优点,三各种能够生产酶的微生物,一来源类别,1、酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物、微生物中，可以直接从生物体中别离提纯而获得，早期酶的生产多是以动植物为主要原料提取而得。,2、人工合成酶的方法，目前还受到试剂、设备条件的限制。,3、利用动物、植物细胞和组织培养方法来生产酶，由于周期较长、本钱较高，也存在一定难度。,4、利用微生物生产酶制剂。,二利用微生物生产酶制剂的优点,1能够生产酶的微生物种类繁多，有较大的选择余地。,2微生物繁殖快、培养周期短、培养方法简便，培养过程容易控制，,3微生物具有较强的适应性，能够培育出新的高产菌株。,三各种能够生产酶的微生物,1、氧化-复原酶,1葡萄糖氧化酶来源于霉菌,2D氨基酸氧化酶来源于霉菌、肾脏,3尿激酶来源于酵母菌、肾脏,4过氧化氢酶来源于细菌、霉菌、红血球,5近氧化物酶来源于植物,2、转移酶,1转氨基酶来源于细菌、动物肝脏,2核苷磷酸转移酶来源于细菌,3、水解酶,4、裂合酶,5、异构酶,3、水解酶,脂肪酶来源于细菌、霉菌、胰脏5-磷酸二酯酶来源于霉菌淀粉酶来源于细菌、霉菌、胰脏、麦芽果胶酶来源于细菌、霉菌纤维素酶来源于霉菌、蘑菇半纤维素酶来源于霉菌溶菌酶来源于细菌、鸡卵白蜜二糖酶来源于霉菌乳糖酶来源于细菌、霉菌转化酶来源于细菌、酵母透明质酸酶来源于细菌、动物睾丸凝乳酶来源于霉菌、小牛胃、羊胃天冬酰胺酶来源于细菌脲酶来源于豆科植物青霉素酰化酶来源于细菌、霉菌氨基酰化酶来源于细菌、霉菌、牛肾脏橙皮苷酶来源于霉菌蛋白酶来源于霉菌、放线菌、动物内脏、植物瓜果,裂合酶和异构酶,4、裂合酶,天冬氨酸-脱羧酶来源于细菌,-酪氨酸酶来源于细菌,延胡索酸酶来源于细菌,谷氨酸脱羧酶来源于细菌,5、异构酶,氨基酸消旋酶来源于细菌、霉菌、酵母,葡萄糖异构酶来源于细菌、放线菌,四、酶的生产菌种,1、对生产菌种的要求,2、目前常用的产酶微生物,1、对生产菌种的要求,1产酶量高,2不是致病菌,3性能稳定，不容易变异、退化、不易感染噬菌体。,4能够利用廉价的原料，发酵周期短、易于培养。,2、目前常用的产酶微生物,大肠杆菌-用来生产谷氨酸脱羧酶、天门冬氨酸酶、青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶。,曲霉黑曲霉、黄曲霉-用来生产糖化酶、蛋白酶、淀粉酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、氨基酰化酶、脂肪酶。,枯草杆菌-用于生产a-淀粉酶、-葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酯酶。,啤酒酵母-用来生产转化酶、丙酮酸脱羧酶、乙醇脱氢酶。,青霉菌-用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶、5-磷酸二酯酶、脂肪酶。,木霉菌-用于生产纤维素酶。,根霉菌-用于生产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶。,链霉菌-用来生产葡萄糖异构酶。,五、产酶菌株的制备和优化,1、产酶菌株的培养条件,2、菌种的别离筛选,3、菌种的变异诱导技术,4、原生质体诱导实际生产例子,1、产酶菌株的培养条件,1产酶促进剂,2影响酶产量的各种因素,3诱导剂和抑制剂,1产酶促进剂,在酶制剂的生产过程中，如果添加少量的某种物质就能增加酶的产量，那么这类物质就称为产酶促进剂。,产酶促进剂多数是酶的诱导物、或者是外表活性剂，常用的产酶促进剂有：,A吐温-80,B脂肪酰胺磺酸钠,C聚乙烯醇,D糖脂,E乙二胺四乙酸EDTA,2影响酶产量的各种因素,A、温度-各种产酶微生物对于温度的要求是各不相同的。,细菌：35-37度,霉菌：30度,酵母菌：30-35度,B、PH值-通过掌握原料的配比保持一定的C/N水平、或者通过添加缓冲剂、能够控制发酵液的PH值。,C、通气量供氧量,讫今为止，产酶和微生物都是需氧性的微生物。,在液体深层发酵中，微生物利用的氧必须是溶解于培养基中和溶解氧。,空气中的氧气-培养基溶解氧-透过细胞膜进入原生质。,精确测定时采用溶氧仪。,D、搅拌-搅拌可将泡沫打碎、增加氧气的溶解速度、加强了液体的湍流作用，有利于营养物质与菌体细胞的接触，促进细胞新陈代谢。,E、泡沫,E、泡沫,酶制剂发酵过程中泡沫较多。泡沫的存在会阻止CO2的排除、同时直接影响O2的溶解。,排除常常采用：机械力消泡沫法、化学消泡剂消泡沫法。,常用的消泡剂有：天然油类、矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、磷酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷等等物质。,国内酶制剂工业常用的消泡剂为：,甘油聚醚聚氧丙烯甘油醚,泡敌聚环氧丙烷环氧乙烷甘油醚,3诱导剂和抑制剂,某些酶反响，当培养基中不存在诱导物质时，其酶的合成就受到抑制，而当添加诱导物质时，酶的合成就能顺利进行，这类物质称作诱导剂。,使用某些酶的抑制剂常常能够促进酶的合成，如在多粘芽孢杆菌的培养基中添加淀粉酶抑制剂S-AI，能增加淀粉酶的产量。,在酶的生产中，参加适量外表活性剂，也能提高酶制剂产量，如用爪哇真青霉生产纤维素酶时，如果添加0.1%的吐温-80，那么纤维素酶的产量可提高4倍。,2、菌种的别离筛选,1含菌样品质采集,2富集培养,3菌种纯化,3、菌种的变异诱导技术,1采用物理、化学方法进行诱导,物理方法-紫外线、X射线、-射线、高能电子、快速中子。,化学方法-亚硝基胍、亚硝酸。,2采用基因工程技术进行诱导,德国的生物技术人员，提取出大肠杆菌的青霉素酰化酶基因，通过质粒pBR233，克隆到宿主大肠杆菌中，新构建的工程菌，其产酶能力提高了50倍。,在国内，有人将产生葡萄糖异构酶的放线菌基因，通过质粒pBR233，克隆到宿主大肠杆菌中，新构建的工程菌，其表观活力提高了5倍。,有人在研究霉菌的淀粉酶基因、或者纤维素基因克隆到酵母菌中，一旦获得成功，就能够利用淀粉、纤维素为原料，以酵母菌作为载体，通过发酵来生产酒精。,3采用原生质体融合技术进行诱导,原生质体融合育种的频率要高于普通杂交的方法。不同种属之间也可进行融合。,在曲霉与曲霉、青霉与青霉、链霉菌与链霉菌、芽孢杆菌与芽孢杆菌之间的融合应用较多。,4、原生质体诱导实际生产例子,蛋白酶产生菌种之间的原生质体融合共分为7步：,A、使用的亲本菌株,B、菌株标记的获得,C、原生质体的制备,D、细胞的再生,E、原生质的融合,F、融合子的继代培养、检验和生产性能,A、使用的亲本菌株,二亲本为：,1枯草杆菌,2地衣芽孢杆菌,二者都是野生型，对利福平和链霉素敏感。,B、菌株标记的获得,采用紫外线进行诱变，,筛选营养缺陷型菌株、和抗药性菌株，,经过十代以上传代，形成稳定的突变菌株。,C、原生质体的制备,二亲本接种入完全培养基，37摇瓶培养20小时离心收集菌体，悬浮于0。55mol的NaCl溶液中经4000r/min离心15分钟，洗涤2-3次，离心，弃去上清液菌体细胞悬浮于SMM缓冲液中参加采用SMM液配制的溶菌酶1000单位/ml，置恒温水浴溶解细胞壁，定时取样镜检，并用计数板计数。待原生质球形成之后，以4000-6000r/min离心2次，每次15分钟，洗涤2-3次、离心放于无菌蒸馏水中，使原生质体膨胀适当稀释，涂布于完全培养基上32下、培养20小时得原生质体,D、细胞的再生,mol的NaCl溶液之中,适当稀释，涂布于完全培养基上,32,下、培养24小时得原生质体再生的细胞,E、原生质的融合,取等量的二亲本原生质体、参加SMM溶液混匀经4000r/min离心25分钟，弃上清液参加由SMM配制的、含30%的、分子量为6000的PEG2-4ml在40下搅匀、保温2-3分钟。参加3-10倍量的SMMml/皿涂布到含有二种抗生素的高渗完全培养基上，链霉素含量为2000单位/ml，利福平含量为10单位/ml，32下、培养20-36小时得初步的原生质体融合子,F、融合子的继代培养和检验和生产性能,将,初步的原生质体融合子在含有链霉素+利福平的平板培养基上连续传代，可以检测出稳定的原生质体融合子。,融合菌株的生产性能比亲株高出30%。,第二节 药用酶的生产,一、激肽释放酶,二、双链酶,三、超氧化物歧化酶,四、链激酶,五、链道酶,六、弹性酶,七、胰酶,八、含糖蛋白酶,九、糜胰蛋白酶,十、淀粉酶,十一、菠萝蛋白酶,十二、,-半乳糖苷酶,十三、天门冬酰胺酶,十四、尿激酶,一、激肽释放酶,1、药理功能-具有扩张血管的功能，并能提高血管通透性，起到改善血液循环的作用。,2、临床应用-治疗动脉硬化、血管炎、四肢皮肤溃疡。,3、生产方法1提取法生产-以猪的颔下腺为原料进行提取。2提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。,二、双链酶,1、药理作用-内含二种酶，二者合用可去除炎症物、脓块、瘀血，促进外伤伤愈合。 1为链激酶SK、又称为溶栓酶。能溶解血栓和渗出物的纤维局部。2为链道酶SD、又称为脱氧核糖核酸酶。能够液化死细胞,2、临床应用-治疗血肿、脓肿、骨髓炎、创伤性感染、溃疡。,3、生产方法-细菌发酵法生产。,三、超氧化物歧化酶,1、药理作用-能专一性地去除人体内的超氧阴离子自由基。,2、临床应用-治疗类风湿关节炎，自身免疫疾病、心肌缺血、抗衰老、断肢再植、整形美容。,3、生产方法1提取法-从新鲜猪血中提取2提取法-从玉米中提取,链激酶和链道酶,四：链激酶,链激酶SK称为溶栓酶。能溶解血栓和渗出物的纤维局部。,生产方法-由-溶血性链球菌发酵生产,五：链道酶,链道酶SD又称为脱氧核糖核酸酶。能够液化死细胞。,发酵法生产-由-溶血性链球菌发酵生产。,六、弹性酶,1、药理作用-能够水解弹性蛋白、血纤维蛋白、血红蛋白。,2、临床应用-用于治疗高血脂、慢性支气管炎、动脉硬化、高血压、脂肪肝。,3、生产方法提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。,七、胰酶,1、药理作用-其成份为胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶。能够消化淀粉、蛋白质、脂肪。,2、临床应用-助消化，增加食欲。,3、生产方法提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。,八、含糖蛋白酶,1、药理作用-是一种蛋白质消化酶,2、临床应用-助消化，增加食欲,3、生产方法提取法生产-以猪的胰脏为原料进行提取。,九、糜胰蛋白酶,1、药理作用-是一种蛋白质消化酶,2、临床应用-助消化，增加食欲,3、生产方法提取法生产-以牛羊的肠粘膜为原料进行提取。,十、淀粉酶,1、药理作用-是一种消化酶,2、临床应用-助消化，增加食欲,3、生产方法发酵法生产-以黄曲霉发酵生产。,十一、菠萝蛋白酶,1、药理作用-具有消炎、抗水肿的作用。,2、临床应用-治疗炎症、水肿、血肿、支气管炎、肺之、乳腺炎、静脉炎。,3、生产方法提取法生产-以菠萝的皮为原料进行提取。,十二、,-半乳糖苷酶,1：药理作用-消化酶，能够消化乳糖,2：临床应用-适用于婴儿乳糖消化不良。,3：生产方法发酵法生产-以毛霉米曲酶发酵生产。,十三、天门冬酰胺酶,一药理作用和临床应用,1、药理作用-对肿瘤细胞具有抑制作用。,2、临床应用-抗肿瘤制剂,二生产方法,二生产方法,发酵法生产-以大肠杆菌发酵生产。,大肠杆菌种子级菌种参加玉米浆，发酵罐、37下培养7小时取发酵液，参加丙酮后压滤滤饼风干，得干菌体参加硼酸缓冲液，PH=8、37下提取得提取液，加醋酸调节PH=4。3，得沉淀物，即为干粗酶参加甘氨酸，60热处理30分钟得酶溶液，参加聚乙二醇，在不同的PH值下进行精制得无热源酶液冻干、无菌分装得天门冬酰胺酶冻干制剂,十四、尿激酶,1、药理作用-是一种蛋白质水解酶，具有溶血作用和降血压作用,2、临床应用-抗血栓,3、生产方法提取法生产-以男性新鲜尿液为原料进行提取。,第三节 固定化酶工程,一、酶和细胞的固定化,二、固定化酶的制备技术,三、固定化细胞的制备技术,四、固定化生物反响器,一、酶和细胞的固定化,一固定化酶的定义,二固定化生物催化剂的特点,三酶固定化的方法分类,四细胞固定化的方法分类,五固定化技术所用载体,一固定化酶的定义,固定化酶是指限制或者固定于特定空间位置的酶，具体来说，就是指经过物理、化学方法处理，使酶变成不易随水流失的固定化催化剂。,制备固定化酶的过程称为酶的固定化。,酶可以采用经过别离后高纯度的提纯酶、也可以是菌体细胞碎片上的酶系，甚至可以是死细胞上的酶。,二固定化生物催化剂的特点,1固定化酶属于修饰酶，这种酶可以通过化学、生物、分子工程手段加以改进。,2固定化酶的稳定性很高，可以屡次连续使用。,3反响以后，产物中不含酶，易于纯化。,4反响条件易于控制，可实现连续化和自动控制。,5酶的利用率高，酶的实际使用量较少。,6固定化酶比水溶性酶更适合进行多酶反响。,三酶固定化的方法分类,1、载体结合法,2、交联法,3、包埋法,1、载体结合法,1物理吸附法,2离子结合法,3共价键结合法,1物理吸附法,A、物理吸附法的优点：1操作简单2可选用不同的吸附剂3酶失活之后，载体可以再生,B、物理吸附法的缺点：1酶的最适吸附量无规律可寻2酶与载体之间的吸附力不强，酶容易脱落。,C、常用的吸附剂,C、常用的吸附剂,活性炭碳酸钙-每克载体能吸附1mg酶蛋白。纤维素多孔玻璃酸性白土漂白土高岭石氧化铝硅胶膨润土羟基磷灰石磷酸钙金属氧化物-二氧化钛覆盖后的不锈钢颗粒，直径为100-200um，每克载体能吸附17mg酶蛋白。淀粉谷蛋白陶瓷丁基葡聚糖凝胶已基葡聚糖凝胶单宁纤维素衍生物,2离子结合法,A、离子结合法的优点,-操作简单、处理条件温和，酶的活性中心不容易被破坏。,B、离子结合法的缺点,-载体和酶的结合力较弱、常常发生酶脱落的现象,C、常用的离子结合剂,树脂-阴离子交换树脂、阳离子交换树脂、多糖类离子交换剂、合成高分子类离子交换剂。每克载体能吸附50-150mg酶蛋白。,DEAE-纤维素,Amberlite-CG-50,Amberlite-XE-97,Amberlite-IR-45,Dowex-50,3共价键结合法,酶分子上的氨基、羧基、羟基、咪唑基、巯基与载体外表的反响基团形成共价键，因而将酶固定在载体上的方法。,A、共价键结合法的优点-酶与载体结合牢固，酶不会发生脱落。,B、共价键结合法的缺点-操作复杂、反响条件苛刻，酶的活性中心会遭到局部性的破坏。,C、共价键结合法的类别,重氮化迭氮化酸酐活化法酰氯法异硫氰酸酯法缩合剂法溴化氰活化法烷基化法纪硅烷基化法,2、交联法,1交联的优缺点,2交联法的类别和内容,3参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂,1交联的优缺点,交联法是采用双功能、或者多功能试剂，使得酶与酶之间发生交联的固定化方法。基团之间的交联通过共价键结合。,交联法的优点-交联后的酶活性较高,交联法的缺点-反响条件剧烈、酶的回收率低。,2交联法的类别和内容,类别,酶与酶交联法,酶与辅助蛋白交联法,吸附交联法,载体交联法,内容,分子内交联,分子间交联,酶与辅助蛋白分子之间交联,酶与载体之间交联,3参与交联的酶蛋白功能团和常用的交联剂,参与交联的酶蛋白功能团,N-末端的,-氨基,赖氨酸的,-氨基,酪氨酸的酚基,半胱氨酸的巯基,组氨酸的咪唑基,常用的交联剂,戊二醛,双重氮联苯胺-2、2-二磺酸,1、5-二氟-2、4-二硝基苯,已二酰亚胺二甲酯,3、包埋法,包埋法的优点-不需要改变酶的高级结构，酶的回收率较高。,包埋法的缺点-包埋酶容易导致酶的失活，包埋法只适用于小分子底物的反响过程，大分子底物由于无法进入凝胶，故不适用。,包埋法分为三类1凝胶包埋法2微囊化包埋法3纤维包埋法,1凝胶包埋法,凝胶包埋法也称网格法，是指将酶包埋在高分子凝胶的细策网格之中。凝胶包埋法是目前因定化技术中用得最多的方法。所用的凝胶有：,聚丙烯酰胺聚乙烯醇光敏树脂淀粉明胶胶原海藻胶卡拉胶角叉菜胶,2微囊化包埋法,将酶包埋在高分子半透膜中的方法，称为微囊化包埋法。,微囊化固定化酶的优点-微囊化固定化酶的直径为几微米到几百微米之间的球状体，其颗粒较小，有利于大分子底物进行反响。,微囊化固定化酶的缺点-反响条件要求高，制备本钱也较高。,3纤维包埋法,此法适用于大规模生产。纤维包埋法所形成的聚合物，每克能够包埋1500mg的转化酶，并且具有良好的稳定性。,制备时，先把含酶水溶液在高聚物醋酸纤维素、聚氯乙烯的有机溶剂二氯甲烷中进行乳化，然后将乳化液通过一多孔喷丝头挤压进凝结浴池中，形成纤维酶溶液便被包裹在纤维内将纤维编织成各种酶布，以适合反响器的要求。,四细胞固定化的方法分类,1交联法,2包埋法,3选择性热变性法-此法专用于细胞固定化，是将细胞在适当温度下处理，使其细胞膜蛋白质变性，但不使其酶变性，从而使酶固定于细胞内的方法。,五固定化技术所用载体,1、固定化载体必须符合的条件,1固定化过程不传统引起酶变性。,2对酸碱具有一定的耐受性。,3具有一定的机械强度。,4具有一定的亲水性，并且具有良好的稳定性。,5具有一定的疏松网状结构，颗粒均匀。,6进行共价键结合时，具有可活化基团。,7有耐受酶和微生物细胞的能力。,8廉价易得。,2、常用的固定化载体,1物理吸附载体,2离子吸附载体,3包埋法吸附载体,4共价键结合载体,1物理吸附载体,活性炭碳酸钙纤维素,漂白土高岭石石英砂,氧化铝硅胶矾土,膨润土胶棉羟基磷灰石,磷酸钙凝胶淀粉谷蛋白,陶瓷二氧化硅皂土,煤渣多孔玻璃酸性白土,金属氧化物二氧化钛覆盖后的不锈钢颗粒,丁基葡聚糖凝胶,单宁纤维素衍生物,已基葡聚糖凝胶,2离子吸附载体,阳离子交换树脂,阴离子交换树脂,DEAE-纤维素,TEAT-纤维素,羧甲基纤维素,DEAE-SephadexA50,Amberlite-CG-50,Amberlite-XE-97,Amberlite-IR-45,Dowex-50,3包埋法吸附载体,聚丙烯酰胺凝胶三醋酸纤维素,二醋酸纤维素甲壳素,硅胶聚乙烯醇,丙烯酸高取物琼脂,琼脂糖光敏树脂,淀粉明胶,胶原海藻胶,卡拉胶角叉菜胶,4共价键结合载体,纤维素SephadexA200,琼脂琼脂糖,苯胺多孔玻璃对氨基苯纤维素,聚丙烯酰胺胶原,尼龙多聚氨基酸,多孔玻璃珠金属氧化物,二、固定化酶的制备技术,一固定化酶的制备,二固定化酶的形状和性质,三固定化酶的活力测定方法,一固定化酶的制备,1、固定化方法的选择,1固定化酶应用的平安性，应该附合药用和食用标准。,2固定化酶的稳定性，能够长期反复使用。,3固定化酶的本钱、水、电、气、设备、劳务等费用。,2、固定化酶的选择-目前在工业化大生产经常应用的有：,1聚乙烯醇,2卡拉胶,3海藻胶。,3、固定化酶制备技术,3、固定化酶制备技术,1物理吸附法-将酶的水溶液与具有高度吸附能力的载体混合，然后洗去杂质和未吸附的酶，即得固定化酶。,2离子吸附法-将解离状态的酶溶液与离子交换基混合后，洗去杂质和未吸附的酶，即得固定化酶。,3凝胶包埋法-将凝胶材料卡拉胶、海藻胶、琼脂及明胶与水混合，加热使之溶解，再降至其凝固点温度，然后参加预保温的酶溶液、混合均匀，最后冷却凝固成型、即成固定化酶。,4凝固包埋联合法-在进行聚丙烯酰胺包埋时，将酶、混合单体、交联缓冲剂一起混合，再参加催化剂，在单体产生聚合反响形成凝胶的同时，将酶限制在网格之中，经过破碎后就成为固定化酶。,5脂质体包埋法-这是一种采用外表活性剂和磷脂酰胆碱等物质，形成液膜来包埋酶的方法。,6纤维包埋法-即前面已经讲述的酶布包埋方法。,7共价键结合法-实质上是一种酶 与包埋剂之间的化学反响过程,8界面沉降微囊包埋法,9界面聚合微囊包埋法,10交联法,8界面沉降微囊包埋法,采用与水不相溶的、沸点比水低的有机相A。,将酶液在有机相A中乳化、形成油包水的微滴。,再在乳化液中参加溶于有机溶剂的高聚物B。,再参加不能溶解高聚物B的另上种有机溶剂C。,结果使得高聚物在油水界面上沉淀、析出，形成微囊型固定化酶。,9界面聚合微囊包埋法,含酶的、10%的血红蛋白溶液 + 已甲叉二胺水溶液-充分混合参加1%的Span-85的氯仿-环已烷进行分散乳化，再参加溶于有机相的癸二酰氯，酶和载体在油-水界面上发生聚合反响，弃去上清液，参加Tween-20去乳化，洗去有机溶剂用未聚合的单体，将聚合物转移到水相之中，就成微囊。所制得的微囊直径在1-300um之间，每1ml酶溶液可以制得2500cm2总外表积的微囊。,10交联法,是指向酶液中参加多功能试剂，在一定的条件下使酶在分子内、或者在分子间形成网络结构，最终形成固定化酶的技术。,交联法可以分为：,1酶与辅助蛋白交联法,2吸附交联法,3载体交联法。,如0.2%的木瓜蛋白酶和0.3%的戊二醛、在PH=、温度为0的条件下，24小时即完成酶的固定化。,二固定化酶的形状和性质,1、固定化酶的形状,2、固定化酶的性质,3、酶稳定性的变化,1、固定化酶的形状,固定化酶的形状-酶膜、酶管、酶纤维、微囊、颗粒状的固定化酶。,1颗粒状的固定化酶-又可分为酶珠、酶块、酶片和酶粉。其制备方法简单、颗粒比外表积大，转化效率高，适用于各类反响器。,2纤维状的固定化酶-只适用于填充床式反响器。,3膜状的固定化酶-也称为酶膜，其外表积大、渗透阻力小，可用于酶电极、破碎之后也可用于填充床反响器，目前已经用于生产木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化物酶、氨基酰化酶、脲酶等。,4管状的固定化酶-其机械强度大，切短之后可用于填充床式反响器，也可组装成列管式反响器。,2、固定化酶的性质,1酶活力的变化-经过固定化之后，酶的活力大都发生下降。,2酶反响特性的变化-底物专一性，酶经过固定化之后，由于位阻效应，其活性会下降。,3最适PH值-酶经过固定化之后，其最适PH值会发生变化。,4最适温度-酶经过固定化之后，其空间结构更加稳定，因此，其最适温度也会提高。,5米氏常数-改变不显著。,6最大反响速度-会产生一定的差异。,3、酶稳定性的变化,1操作稳定性-当固定化酶的稳定半衰期到达1个月以上时，就具有工业应用价值。,2贮藏稳定性-固定化的胰蛋白酶在20保存数月，其活性不变。,3对热稳定性-由于加热提高了反响速度，从而提高反响效率。,4对蛋白酶的稳定性-大多数天然酶在经过固定化之后，它们对于蛋白酶的耐受力均有大幅度提高。这在工业生产中是极为有利的。,三固定化酶的活力测定方法,在酶促反响中，其底物或者产物具有光吸收、旋光、电位差、荧光等变化，可以使用分光光度计进行直接测定。,1分批测定法固定化酶在搅拌、振荡的情况下，每间隔一定时间取样，过滤之后按常规方法测定。,2连续测定法从反响器中引出反响液到流动比色杯中，在分光光度计中进行连续测定。或者通过测定反响过程中氧气、NH4、电导率、消化系数来确定酶的活力。,酶活力测定仪器,三、固定化细胞的制备技术,1、固定化细胞的制备,2、固定化细胞的形状和性质,讫今为止技术上还没有过关的原因：,1细胞培养技术存在着难题。,2固定化之后，细胞的生物学活性存在着障碍。,3细胞固定方法上在套用酶固定化技术，但是细胞不同于酶的单分子蛋白质，技术共用难度很大。,在此只能作为标题介绍，不宜展开。,四、固定化生物反响器,1、酶反响器,2、固定化反响器的类型和特点,3、固定化反响器的选择依据,1、酶反响器,用于酶催化反响的装置称为酶反响器，,它可用于溶液酶、也可用于固定化酶。,2、固定化反响器的类型和特点,1间歇式搅拌反响罐BSTR,2连续流动搅拌反响罐CSTR,3填充式反响罐PBR,4流化床反响器FBR,5循环反响器RCR,6连续流动搅拌超滤膜反响器CSTR/UF,7其它反响器,1间歇式搅拌反响罐BSTR,也称为分批搅拌反响器。,其特点是结构简单、操作方便。,其缺点是，经过单一批次的反响之后，酶就随着反响产物流失。,主要用于游离酶反响。当前食品和饮料工业中常用这类反响器。,其方法是将酶和底物一起参加到反响器中，控制反响温度，当到达预期的转化率时，随即放料。,2连续流动搅拌反响罐CSTR,这是一种连续进料、连续出料的反响器。,结构上与间歇式搅拌反响器根本相同。,3填充式反响罐PBR,属于使用最普遍的反响器。主要用于固定化酶生产的反响器。,固定化酶通常以各种形状如球形、碎片、薄片、丸粒填充于反响层内。,固定化酶所使用的载体有多也玻璃珠、珠状离子交换树脂、聚丙烯酰胺凝胶、二乙胺乙基葡聚糖凝胶，胶原蛋白薄膜片。,填充式反响罐系统运转时，底物按照向上流动的方向以恒定的速度通过反响床。,4流化床反响器FBR,在流化床反响器，底物溶液以足够大的流速向上通过反响床。使得固体颗粒处于流化状态，从而来增加反响效率。,由于流化床反响器具有混合程度高，传热性能良好等特点，因此可以用来处理粘性较强的底物、或者用来处理含有固体颗粒的底物。,5循环反响器RCR,这种反响器是让局部反响产物流出，流出物再与原始底物混合之后重新流入反响系统的方法。,循环反响器能够提高液体的流速，并能减少底物在固定化酶外表沉积，从而到达较高的转化效率。,当反响底物是不溶性物质时，可以采用循环反响器生产。,6连续流动搅拌-超滤膜反响器CSTR/UF,连续流动搅拌-超滤膜反响器=连续流动搅拌反响器 + 超滤膜装置。,超滤膜被安装在连续流动搅拌反响器的出口处，这种膜只允许反响产物、或者是未曾反响的底物通过，而分子量较大的酶就被截留在反响器中，从而实现酶的反复利用。,7其它反响器,淤浆式反响器,滴流床反响器,气栓式流动反响器,转盘式反响器,筛板反响器,复合类反响器,3、固定化反响器的选择依据,1根据固定化酶的形状来选择。,2根据底物的物理性质来选择。,3根据外界环境条件对于酶的稳定性来选择。,4根据操作要求和固定化酶反响器的投资费用来选择。,第四节 酶工程应用实例,一、L-天门冬酸生产工艺,二、固定化细胞法生产6-氨基青霉烷酸,三、固定化酶法生产5-复合单核苷酸注射液,四、固定化酶法生产L-氨基酸,五、r-氨基丁酸的生产工艺,六、L-多巴的生产工艺,实例1、酶 工程产品益生源，用于饲料添加剂,例2、酶工程产品万寿胶囊，用于补充人体营养物质,例3、生态复合酶制剂，用于改善环境,例4、酶工程药品和化装品原料,例5、膜反响器，用于污水处理,第五节 酶工程研究进展,一、酶的化学修饰,二、酶的人工模拟,三、有机相中的酶反响,四、基因工程酶的构建略,一、酶的化学修饰,1、关于酶的化学修饰,2、常用的化学修饰剂,3、化学修饰方法,4、修饰酶所具有的新特征,1、关于酶的化学修饰,1原因-但是由于酶是一种蛋白质，常常在应用过程中出现异体蛋白的抗原性、容易被水解、容易受抑制、在反响系统中半衰期较短等缺点。,因此提高酶的稳定性、解除酶的抗原性就成为技术关键。,2定义-酶的化学修饰就是在分子水平上，采用化学方法对酶进行改造，通过添加一些化学基团，或者采用具有生物相容性的大分子进行共价键联接，从而改变酶分子性质的一种技术。,2、常用的化学修饰剂,化学修饰剂的要求-具有较大的分子量，具有良好的生物相容性、具有水溶性，分子外表具有较多的反响基团。,1糖以及糖的衍生物-右旋糖苷、右旋糖苷硫酸酯、糖肽、葡聚糖凝胶、聚乳糖。,2高分子多聚物-聚乙二醇PEG、聚乙烯醇PVA、聚N-乙烯吡咯烷酮PVP、聚丙烯酸PAA。,3生物大分子-肝素、血浆蛋白质、聚氨基酸。,4双功能试剂-戊二醛、二异硫氰酸、二胺类。,5其它试剂-糖基化试剂、甲基化试剂、乙基化试剂。,3、化学修饰方法,1修饰酶的功能基团-如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基。来提高稳定性。,2在酶分子内进行交联、或者进行分子间的交联-提高酶解能力、消除抗原性。,3修饰酶的辅助因子-提高稳定性。,4使酶与高分子化合物相结合-提高稳定性。,4、修饰酶所具有的新特征,1对热的稳定性有所提高。,2具有对抗各类失活因子的能力。,3抗原性消除。,4体内的半衰期有所延长。,5最适PH值发生改变。,6酶反响特性发生变化。,7在人体组织中的分布能力发生变化，有利于被靶器官选择性的吸收。,二、酶的人工模拟,根据酶的作用原理，采用人工方法合成的，具有活性中心和催化反响作用的、非蛋白质结构的化合物，称为人工模拟酶。,人工模拟酶的构成条件：,1具有能够识别底物的分子结构，,2具有酶活性部位的催化基团。,1、环糊精,2、分子印迹技术,1、环糊精,它具有一个疏水的结合部位，能与有机分子形成包络物，同时，它还能催化一些反响。,环糊精分子是一个椅子状的空穴结构，空穴的边缘是一些葡萄糖羟基，使得环湖精能够溶液于水。,空穴的中间那么是疏水结构，能够将有机小分子束缚到空穴之中。,环糊精的酶促反响过程为-参与反响的底物先被环糊精分子包束，然后再发生酶促反响。,环糊精所模拟的胰凝乳蛋白酶，其催化效率与天然的胰凝乳蛋白酶相同。但是，环糊精的对热稳定性、对PH值稳定性那么大大高于天然的胰凝乳蛋白酶。,2、分子印迹技术,分子印迹技术是制备针对某一特定分子具有特异性结合能力的聚合物的过程。,其实质已经接近于基因芯片技术,1分子印迹技术的过程,2分子印迹技术的应用价值,1分子印迹技术的过程,1特定分子 + 特异性结合的功能单体，发生互补性结合作用，形成特定分子-功能单体复合物。,2采用交联剂，在特定分子-功能单体复合物周围发生聚合反响，形成交联聚合物。,3从聚合物中除去特定分子，得到具有反响选择性的模板。,2分子印迹技术的应用价值,1别离手性药物。,2作为人工模拟酶，进行聚合反响。,3用于构建成生物传感器。,三、有机相中的酶反响,通常情况下，作为蛋白质的酶 反响只能在水溶液中进行。20世纪80年代开始，有学者开始试验在非水介质中进行酶催化反响，即进行有机溶液相中的酶反响。,有机相中的酶反响-酶在具有有机溶剂存在的介质中所进行的催化反响，称为有机相中的酶反响。,一有机相中的酶反响的优点,二酶反响有机相的构建,一有机相中的酶反响的优点,1、可用来进行疏水性底物的酶促反响。,2、有利于酶种反响平衡向反响产物方向移动。,3、可抑制水溶性物质带来的副反响，如产物的水解。,4、由于酶不溶于有机溶液剂中，有利于酶的回收。,5、容易从有机溶液剂中别离出纯化产物。,6、在有机溶剂中，酶的热稳定性提高。PH的适应性扩大。,7、有机溶剂中无微生物污染。,二酶反响有机相的构建,1、水-可溶性有机溶剂均一体系,2、水-不溶性有机溶剂两相体系,3、油包水系反向胶团体系,4、有机溶剂单向体系,1、水-可溶性有机溶剂均一体系,在水溶液中参加可溶性的有机溶剂，如乙醇、丙酮、甘油等。,其目的在于提高反响产物的浓度。,目前在氨苄青霉素生产中应用。,2、水-不溶性有机溶剂两相体系,该体系要求：底物既溶于水、又能溶于有机溶剂。而产物那么不溶于水。,常用的有机溶剂有：三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醚。,3、油包水系反向胶团体系,油包水系反向胶团体系能够使酶维持在一个类似于细胞的环境之中，有利于酶 活性的表达。,油包水系反向胶团体系属于乳剂体系。,1根本原理,2乳基的二种类型,1根本原理,油相与水相在乳化剂的作用下，可形成半固体状的乳基。,常用的油相有-硬脂酸、蜂蜡、液体石蜡高级脂肪醇。,常用的水相有-水、盐溶液、甘油等。,常用的乳化剂有-皂类、月桂醇硫酸钠、单硬脂酸甘油酯，吐温类、壬烷基酚聚乙二醇醚OP,2乳基的二种类型,A油包水型,也称护肤脂型，或称为冷霜，能吸收水但不能与水相混合。,制作方法：取蜂蜡、或者液状石蜡，放于蒸发皿中，水浴加热使其熔化，保持温度在70,左右。另取硼砂溶液于70的水中，然后将水相缓缓注入到油相之中，不断搅拌至冷凝，即成,油包水型乳剂。,B水包油型,也称雪化膏型。其含水量较大，并能与水混合。,制作方法：取硬脂酸放于蒸发皿中，水浴加热使其熔化，保持温度在80,左右。另取氢氧化钾配制成水溶液、并维持温度80。然后将油相缓缓注入到水相之中，不断搅拌至冷凝，即成水,包油型乳剂。,4、有机溶剂单向体系,在该体系之中，含有极微量的水。即只是在酶分子周围存在着一层水分子膜，属于反响所需要的必需水，以维持催化反响的政常进行。,所用的有机溶剂是：苯、正已烷、环已烷。,有机相中酶反响的要求：要根据酶的性质、底物和产物的溶解度、反响器的类型，来选择有机溶液剂的体系和种类。,四、基因工程酶的构建,由于这局部内容涉及基因工程技术，技术上主要是将产酶蛋白质的基因通过克隆形成表达体系，然后进行发酵生产。,1、基因细胞生物反响器之间的尺度,2、基因细胞生物反响器多尺度研究,1、基因细胞生物反响器之间的尺度,2、基因细胞生物反响器多尺度研究,