动物细胞培养技术

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,动物细胞培养技术,1.,动物细胞的生长与培养,动物细胞的特点,进化程度高,结构、形态、成分复杂,细胞间连接形式多样,生长相对缓慢,功能全面,1.1,培养细胞的生物学特征,Hepatocytes,体外培养细胞的分型,（一）贴附型,成纤维细胞型,上皮型细胞,游走细胞型,多形型细胞,（二）悬浮型,（三）半贴壁型,（一）贴附型：,大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞,贴附,:,是大多数有机体,细胞,在体内,生存,和,生长发育,的,基本存在方式,结果,:,基于贴附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须,贴附,于一,固相表面,才能,生存,和,生长,。,培养时：,这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要贴附于某一固相表面才能生存和生长，因而,属于贴附型细胞,贴附,(,锚定或锚着,),依赖型,(,性,),细胞：,唯有贴附于固相表面才能生存的细胞,细胞在体内、外,的,贴附,方式：,存在差异,体内：,贴附,是,全方位,外形,具有,复杂的立体特征,体外：,多数情况，细胞只有,一个附着平面,，,外,形,一般,与体内时明显不同,贴附的固相表面：,玻璃、聚苯乙烯塑料,按照培养细胞的主要形态，可分为,几大类型,1,、成纤维细胞型：,名称：,凡在,培养中形态与成纤维细胞类似,的,来源：,由,中胚层间充质组织起源,的组织如：,真正的成纤维细胞：心肌，平滑肌，成骨细胞，,血管内皮,形态：,似体内成纤维细胞的形态，,胞体梭形或不规则,三角形，胞质向外伸出,23,个长短不等的突起，,中有卵圆形核,生长特点：,排列成放射状，漩涡状,，,并不紧靠连成片,，,细胞,细胞接触易断开而,单独行动，,游离的,单独,的,成纤维样细胞，常有几个,伸长的细胞突起,2,、上皮型细胞：,名称：,仅形态上似体内,，实际上不完全相同,来源：,来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤,形态：,类似,体内的,上皮细胞,，,扁平,，,不规则多角形,，中有圆形核,生长特点：,易相连,成片，,相靠,紧密相连,成薄层,铺石状生长,时呈,膜状,移动，,很少,脱离细胞群而,单个活动,3,、游走细胞型：,呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。,4,、多型细胞型：,有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,（二）悬浮型：,见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,概念：,培养时,不贴附于底物而呈悬浮状态生长,或以机械方法使保持悬浮状态下生长,来源：,自血，脾或骨髓，血中白细胞癌肿细胞,特点：,在,悬浮中生长良好,细胞,圆形,，单个或小细胞团,优点：,生存空间大，,提供数量大，传代方便,(,不需消化,),，,易于收获，,可获得稳定状态,缺点：,纯化不方便，不能通过离心将死、活细胞分离,无菌无毒害的环境,1,支持生长增殖的营养,2,其它类似体内的环境,3,维持细胞性状,4,1.2,细胞培养总原则,(,一,),细胞培养无菌无毒环境,实验室设计合理,常用设施及设备,培养器皿：,透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。,细胞培养无菌操作基本技术,工作环境及表面的处理,细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理,培养液与培养细胞的处理,(,二,),细胞的营养,培养基：,合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。,血清：,血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分,。,其它成分（条件培养基）,合成培养基的主要成分,氨基酸,碳水化合物,无机盐,维生素,其它辅助物质,培养基种类,RPMI-1640,（标准型）,DMEM-,高糖（标准型）,DMEM-,低糖（标准型）,McCoys 5A,M199,F12,血清,牛血清、马血清、人血清,（,1,）储存于,-20 - 70,低温冰箱中,（,2,）一般厂商提供的血清为无菌,（,3,）热灭活是指,56, 30,分钟加热已完全解冻的血清，目的是使血清中的补体成分（,complement,）灭活,（,4,）血清中的沉淀物絮状物，可用离心,3000rpm, 5,分钟去除，也可不用处理。,其它常用液体试剂,Hanks,D-Hanks,PBS,NaHCO3,（,7.5%,）,胰酶溶液（,0.25%,）,(,三,),其它类似体内的环境,温度,气体,渗透压,氢离子浓度,(PH),其他,(,四,),合理的计划，维持细胞性状,尽早冻存原代细胞，复苏后状态恢复的细胞以及转染后稳定存在的细胞,需要做实验的细胞要选对数生长期,防止细胞污染，如遇污染，及时处理,一、细菌污染,细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细,胞培养液中加入了抗菌素,(,一般为预防剂量,),，也可能,因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌。,培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，,pH,改,变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下,发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后,细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆,脱落死亡，造成试验失败和细胞株,(,系,),丢失。,二、真菌污染,真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节,进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔,子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。,培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的,小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下,可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基,中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边,和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶,用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相,混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒,性作用而使细胞脱落死亡。,三、支原体污染,支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微,生物，最小直径，一般过滤除菌无法去除,它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发,现，能在偏碱条件,8.0),下生存，对青霉素,有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。,电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子,密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。,培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生,长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细,胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，,还会产生交叉污染。,四、病毒污染,采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在,病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原,代猴肾细胞的培养中已发现不少于,20,种血清性病毒。,尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗,是不安全的。若二倍体细胞系有,SV40,或多发瘤病,毒，,B,淋巴细胞含,EB,病毒，细胞会发生变异、转,化，形成异倍体的细胞系。,五、非同种细胞污染,由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没,有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一,种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞,的混合物，,ERK/KD,细胞是从兔肾中分离出来的，,而现在却认为是,HeLa,细胞。,非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发,生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底,而带入一些有毒化学物质所致。,常用的排除微生物污染的方法,抗生素排除法：采用,5,10,倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用,24,48h,，再换入常规培养物，有时可能奏效。,加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的细胞至于,41,摄氏度作用,5,10h,（最长可达,18h,），以杀灭支原体。,动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤细胞进行培养,与巨噬细胞共培养：巨噬细胞在体外可存活,7,10,天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用这一特点，可将少量的污染细胞与足够量的巨噬细胞共培养，从而消除污染。,1.3,培养细胞的生长和增殖过程,幼龄动物,取动物器官,和组织,剪碎组织,胰蛋白酶处理,细胞培,养,单个细胞,细胞,悬液,10,代细胞,50,代细胞,无限传代,原代培养,传代培养,如何界定原代培养和传代培养；,多数组织细胞固定在表面生长和分裂。,随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖,遗传物质改变,遗传物质未改变,原代培养：,从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第,1,代细胞与传,10,代以内的细胞称为原代细胞培养。,传代培养：,将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,有关概念,细胞的原代培养,将动物机体的各种组织从机体中取出，经,各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用,EDTA,）或机械方法处理，分散成单细,胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以,生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。,组织块直接培养法（机械法）,1,、取材：将小鼠拉颈椎致死，置,75%,酒精泡,23,秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置平皿中。,2,、用,Hanks,液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。,3,、用手术剪将肝脏剪成小块（,1-2mm,），再用,Hanks,液洗三次，转移至小青霉素瓶中,4,、将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面,5,、翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。入,37,静置,35,小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），,37,继续培养,胰酶消化法,1,、,取材：将小鼠拉颈椎致死，置,75%,酒精泡,23,秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，将鼠带入超净台内解剖取肝脏，置平皿中。,2,、用,Hanks,液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。,3,、用手术剪将肝脏剪成小块（,1mm2,），再用,Hanks,液洗三次，转移至小青霉素瓶中。,4,、视组织块量加入,56,倍的,0.25%,胰酶液，,37,中消化,2040,分钟，每隔,5,分钟振荡一次,.,5,、加入,2,ml,培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）,用吸管吹打，冲散细胞。,6,、静置，使未分散的组织块下沉。,7,、吸取上层细胞悬液，转移到两个培养皿中，补加适量培养液，,37,下培养。,（一）培养细胞生命期,在培养中持续增殖和生长的时间。,1,原代培养期：,从体内取出组织,接种培养到第一次传代阶段（初代培养）,特点：,1,一,4,周、细胞呈活跃的移动、可见细胞分裂、形态结构和功能活动上与体内原组织相似性、多呈,二倍体核型,细胞群是异质的,，,细胞克隆形成率,很低，即细胞独立生存性差。,2,传代期：,初代培养细胞一经传代后便改称做,细胞系,。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称,二倍体细胞系,。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代,10,50,次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。,3,衰退期：,此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。,在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。,转化的标志之一是细胞可能获得,永生性,或,恶性性,。,细胞永生性,也称不死性，即细胞获持久性增殖,能力，这样的细胞群体称,无限细胞系,，也称,连,续细胞系,。无限细胞系的形成主要发生在第二,期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核,型大多变成,异倍体,。细胞转化亦可用人工方法,诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细,胞永生性和恶性性非同一性状。,（二）组织培养细胞一代生存期,所谓细胞“一代”一词，系指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第,153,代细胞，即指该细胞系已传代,153,次。它与细胞世代或倍增不同；在细胞一代中，细胞能倍增,3,6,次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：,?,潜伏期,指数生长期,停滞期,1,潜伏期：,过程,:,游离,:,悬浮,胞质回缩,全部细胞变为圆球形,吸附,:,贴附底物,一般,24,小时内贴壁,潜伏期,:,可有运动活动,基本无增殖,少,见分裂相,影响因素：,潜伏期的长短与：,细胞种类,接种的细胞密度,培养条件,1.,细胞类型,传代,培养的细胞之,潜伏期,比原代培养的,细胞短,。,传代培养期的细胞,6-24h;,原代,24-96h,或更长,单个细胞快,细胞大团慢,组织块慢,连续细胞系,与发生恶性,转化的细胞,(6-24h),比有限细胞系与正常二倍体细胞的,短,来源：胚胎,组织,:,短,2,天可见细胞生长，成体,:,长,2.,细胞密度,密度越大、数量越多，细胞群体越容易适应体外环境，,潜伏期就短,。相反，即便是在很小的培养空间内，如接种的细胞数量不够大，潜伏期仍会较长,3.,培养条件,培养液、,pH,底物、污染,有毒,2,指数增生期：,这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以,细胞分裂指数,表示，即细胞群中每,1000,个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于,0.1%,0.5%,，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达,3%,5%,。,特点：,是细胞,增生最活跃,、,活力最旺盛,的阶段,培养物中,细胞数量呈指数增长,细胞群体均一,是理想的实验用细胞,接触抑制,密度抑制,3,停滞期：,细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称,平台期,（,Plateau,）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、,pH,降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡,特点,(1),细胞数量：,细胞达,饱和密度，出现密度抑制,。,(2),细胞活动小,(3),生长组分下降,(4),及时传代：,细胞,已中毒,，即使,传代,，也会,影响下一代细胞,的功能状况,潜伏期,指数生长期,停滞期,细胞计数及活力测定,培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数，结果以每毫升细胞数表示。,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力，由组织中分离细胞一般也要检查活力，以了解分离的过程对细胞是否有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和复苏的效果。,细胞计数原理,细胞计数操作步骤,1,、将血球计数板及盖片擦试干净，并将盖片盖在计数板上。,2,、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。,3,、静置,3,分钟。,4,、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：细胞数,/ml,4,大格细胞总数,/ 410000,注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占,10%,以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。,请计算一下,细胞毒实验需要效应细胞与靶细胞的比例为,20,：,1,且靶细胞需要,1,x10,4,/TEST,。,现有效应细胞,10ml,，取,100ul,效应细胞加入,900ul,PBS,中，混匀后记数，细胞浓度为,2,x10,4,/ml,。,靶细胞也有,10ml,，经记数，细胞浓度为,1x10,5,/ml,。,效应细胞共有多少？靶细胞共有多少？,以现有的细胞做实验，能做几个,TEST,？,细胞活力,测定步骤,1,、将细胞悬液以加入试管中。,2,、加入,0.5ml 0.4%,台盼兰染液，染色,2,一,3,分钟。,3,、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。,4,、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力。死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。,哺乳动物细胞冷冻保存,主要目的：,（,1,）保存种子细胞，以便随时取用。,（,2,）降低人力和物力,（,3,）减少细胞被微生物污染的危险性。,（,4,）避免有限细胞系出现衰老或恶性转变,（,5,）减少细胞因传代培养而引起的遗传变异和形态改变,冷冻保存要点,（,1,）冷冻过程要缓慢，有条件的地方，可用程控降温仪，按每分钟,-1,到,-3,速度降温，一直到,-80,以下，然后直接放入液氮中长期保存,（,2,）冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于,90,，无微生物污染。,（,3,）细胞浓度控制在：,1,10,6,1,10,7,/ml,。,（,4,）使用高浓度血清（,30%,）,（,5,）使用合适的细胞冷冻保护剂（,DMSO,、甘油）,细胞冷冻保存液主要成分：冷冻保护剂（,5-,10%,，培养基（,60%,），血清（,30%,）。,细胞冻存实用程序,收集细胞,冻存液重悬分装入冻存管,10,6,-10,7,/mL,4, 40min,-20 30-60 min,-30 30min,-80 ,过夜,液氮罐保存并记录,冷冻保存细胞的解冻与复苏,（,1,）快速解冻,（,2,）解冻操作过程动作要轻,特别注意：,解冻时务必注意安全，预防冷冻管爆裂。要带手套，用镊子将细胞冷冻管从液氮中取出，放入,37,水浴中。切不可直接用手，以免冻伤,冷冻管在水浴中解冻时，液面不可超过冻存管盖面，否则，易发生污染,解冻冷冻保存细胞的离心方法,:,从液氮中取出冻存的细胞，立即放入,37,水浴中快速解冻。,将,1,2ml,冻存细胞液加入到,25ml,新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀。,用,80g,离心,2,3,分钟（,800-1000rpm 5min,），弃上清液。,用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞。,接种细胞到培养瓶中，起始密度不低于,3,10,5,/ml,。,24-48h,后换液。,1.4,体外培养细胞的种类,细胞系,细胞株,二倍体细胞,遗传缺陷细胞,肿瘤细胞,（一）细胞系,初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。,如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系,已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系。,（二）细胞株,从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，,由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株,。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株,（三）二倍体细胞,细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（,2n,细胞占,75,或,80,以上）的细胞群，称,二倍体细胞,。,如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为,假二倍体,。,为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或,2,5,代即大量冻存作为,原种。,（四）遗传缺陷细胞,从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。,（五）肿瘤细胞系或株,这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞系或细胞株的命名,HeLa,：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）,CHO,：中国地鼠卵巢细胞（,Chinese Hamster Ovary,）,宫,-743,：宫颈癌上皮细胞，,1974,年,3,月建立,NIH3T3,：美国国立卫生研究院（,National Institute of Health,）建立；每,3,天传代，每次接种,310,5,细胞毫升。,细胞系或株的鉴定、管理和使用,ATCC,入库细胞要求检测项目如下：,培养简历：,组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等,冻 存 液：,培养基和防冻液名称,细胞活力：,融解前后细胞接种存活率和生长特性,培 养 液：,培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量,细胞形态：,类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性,核 型：,二倍体或多倍体，标记染色体的有无,无污染检测：,包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等,物种检测：,检测同工酶，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测,免疫检测：,一两种血清学检测,细胞建立者：,建立者姓名；检测者姓名,细胞凋亡,细胞凋亡,:,是能量依赖的细胞内死亡程序活化而致的细胞自杀，由基因控制的细胞自主有序的主动死亡过程。,细胞程序性死亡,（,programmed cell death,，,PCD,）,:,指生理性细胞死亡。描述在一个多细胞生物体中某些细胞死亡是个体发育中的一个预定的，并受到严格程序控制的正常组成部分。,细胞凋亡与坏死的区别,坏死 凋亡,1.,性质 病理性，非特异性,非遗传性 生理性或病理性，特异性,遗传性,2.,诱导因素 强烈刺激（极端环境），随机发生 较弱刺激，非随机发生,3.,生化特点 被动过程，无新蛋白合成， 主动过程，有新蛋白合成，,不耗能 耗能,4.,形态变化 细胞结构全面溶解、破坏、 胞膜及细胞器相对完整,细胞肿胀 细胞皱缩，核固缩,电泳 弥散性降解，电泳呈均一,DNA,片段化（,180-200bp,），,DNA,片状 电泳呈“梯”状条带,6.,炎症反应 溶酶体破裂，局部炎症反应 溶酶体相对完整，局部无,炎症反应,7.,凋亡小体 无 有,8.,基因调控 无 有,常用细胞凋亡检测方法,细胞凋亡的形态学检测,磷脂酰丝氨酸外翻分析（,Annexin V,法）,线粒体膜势能的检测,DNA,片断化检测,TUNEL,法,Caspase-3,活性的检测,凋亡相关蛋白,TFAR19,蛋白的表达和细胞定位分析,细胞凋亡的形态学检测,磷脂酰丝氨酸外翻分析（,Annexin V,法）,磷脂酰丝氨酸（,Phosphatidylserine,，,PS,）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，,PS,可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中,.Annexin-V,是一种分子量为,35,36KD,的,Ca2+,依赖性磷脂结合蛋白，能与,PS,高亲和力特异性结合。,碘化丙啶（,propidine iodide,，,PI,）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，,PI,能够透过细胞膜而使细胞核红染。,因此将,Annexin-V,与,PI,匹配使用，就可以将凋,亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来,Annexin V-FITC Fluorescence,PI Fluorescence,Time course of apoptosis in TF-1 cells cultured in GM-CSF-free medium,线粒体膜势能的检测,线粒体在细胞凋亡的过程中起着枢纽作用，多种细胞凋亡刺激因子均可诱导不同的细胞发生凋亡，而线粒体跨膜电位的下降，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、,DNA,断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。,线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。,DNA,片断化检测,细胞凋亡时主要的生化,特征是其染色质发生浓,缩，染色质,DNA,在核小,体单位之间的连接处断,裂，形成,50,300kbp,长,的,DNA,大片段，或,180,200bp,整数倍的寡,核苷酸片段，在凝胶电,泳上表现为梯形电泳图,谱（,DNA ladder,）。,TUNEL,法,细胞凋亡中，染色体,DNA,双链断裂或单链断裂,而产生大量的粘性,3-OH,末端，可在脱氧核糖核,苷酸末端转移酶（,TdT,）的作用下，将脱氧核糖,核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生,物素形成的衍生物标记到,DNA,的,3-,末端，从而,可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖,核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（,terminal -deoxynucleotidyl,transferase mediated nick end labeling,TUNEL,）。,2.,干细胞,什么是干细胞,?,干细胞是具有无限期产生各种分化细胞能力的细胞。它是各种干细胞的统称。通常认为干细胞有几个主要特征：,它们是未分化的，但具有分化成各种特定细胞的能力；,它们可无限地分裂产生大量后裔,;,其子细胞有两种命运，保持为干细胞或分化为特定细胞。,干细胞分类,全能干细胞,如受精卵,多,能干细胞，,如囊胚中的内囊细胞,专能干细胞，,如,造血干细胞,如何得到多能干细胞,干细胞培养过程,干细胞来源：,(1),从发育良好的囊胚中分离内细胞群细胞,ES,细胞,(2),从,5-9,周的胚胎生殖腺中分离出人的,EG,细胞（,embryonic germinate cells,）,(3),恶性胚胎肿瘤或畸胎瘤细胞,（,embryonal carcinoma, EC),(4),生殖克隆（治疗性克隆）：体细胞核转移（,SCNT,）,去核卵细胞,+,体细胞核,克隆,囊胚,分离内细胞群,ES,细胞,干细胞的分离,酶消化后培养,免疫方法去除滋养层细胞,流式细胞仪分离法,培养条件：,(1),特殊的培养液：用,DMEM,培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须氨基酸；,-,巯基乙醇。,(2),以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养细胞。,(3),必须加入,LIF,，抑制细胞分化。,干细胞诱导分化的常用方法,（,1,）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，,如,VGEF,、,bFGF,、,DMSO,和,RA,等,（,2,）将,ES,细胞与特定的细胞共培养,（,3,）将某种分化诱导因子的基因转入,ES,细,胞内,鉴定干细胞的常用方法：,（,1,）细胞形态与结构,（,2,）细胞功能,（,3,）细胞表面的特殊标志,（,4,）细胞内特异基因的表达,胚胎干细胞具有以下特点：,(1),细胞内碱性磷酸酶活性高,(2),端粒酶活性高,(3),不被,Hoechst33342,和,Rhodamine123,染色,(4),细胞膜表面有特殊的标记：,SSEA-3, SSEA-4,TRA-1-60, TRA-1-81,(5),能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植,入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤,(6),可诱导分化为各种成体干细胞,2002,年,3,月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。,目前已有报导,ES,细胞能在适当条件下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等,.,谢谢观赏,