现代生物技术在植物育种上的应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物技术在植物育种中的应用,1,主要内容,生物技术的概念和范围,细胞工程与育种,基因工程与育种,分子标记辅助育种,2,生物技术,生物技术也称生物工程,，是指以现代生命科学为基础，结合先进的工程手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计，发行生物体或加工生物原料，为人类生产出所需的产品或达到某种目的的一门,新兴、综合性学科,。,生物技术,是在分子生物学和细胞生物学基础上结合现代工程学的方法和原理而发展起来的一门综合性科学技术,应用范围广泛：,医药卫生、农林牧渔、轻工、食品、化 工和能源等领域。,3,植物方面：,产量、品质、抗病虫、抗逆性等，,以细胞工程、基因工程、分子标记辅助育种为核心的生物技术在植物育种中已得到广泛应用。,主要涉及：,组织与细胞培养、体细胞突变体筛选、原生质体培养与体细胞杂交、单倍体细胞培养、体细胞胚胎发生与生物反应器、基因分离和转移和分子标记辅助选择育种等技术,4,生物技术应用于育种的必要性,1、人类21世纪面临的三大问题,（人口、资源、环境）,2、传统育种方法的局限,3、生物技术的创造性,（1）打破自然生殖隔离，生物可共享一个基因库,（2）有目的地进行基因重组，克服不良连锁,（3）有效克服环境影响，选择更可靠,5,生物技术在植物育种中应用的重要意义,生物技术应用于植物育种，可以解决传统育种的一些特殊困难，扩大育种的基因来源，提高鉴定和摆地摊的可靠性，加快育种进程，加速繁殖，提高育种效率等，对于解决人口与食物问题以及生物能源问题，具有十分重要意义。,6,组织与器官培养的类别,组织与器官培养的应用,第一节 细胞工程与育种,7,第一节 细胞工程与育种,8,一、组织与器官培养,茎尖和分生组织培养,胚培养,胚珠和子房培养,胚乳培养,离体叶的培养,9,相关的专业术语,细胞全能性：,外植体：,愈伤组织,胚状体,继代培养,10,11,组织与器官培养过程可分四个阶段,无菌培养物的建立,营养繁殖体的增殖,生根培养,植株移栽,各阶段在培养基、生长调节剂的配比和浓度、培养方式和环境上都有不同的要求,12,组织和器官培养在育种中的作用,加快植物新品种和育种繁殖速度,培养无病毒苗木,诱发和离体筛选突变体,进行种质资源长期保存和远距离运输,获得倍性不同的植株,克服种子和萌发中的障碍,克服远缘杂交困难,提供育种中间材料,13,1.,加快植物新品种和育种繁殖速度,14,2.,培养无病毒苗木,15,3. 诱发和离体筛选突变体,16,4. 获得倍性不同的植株,二倍体（左）多倍体（右）水稻,17,5. 克服种子和萌发中的障碍,种子萌发全过程,18,6.,克服远缘杂交困难,19,7. 提供育种中间材料,20,二、花药和花粉培养,花药培养,：其外植体为植物雄性器官的一部分，就培养方法和技术来讲于,器官培养,的范畴,花粉培养：,将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养，有时花粉培养也称为小孢子培养，从培养方法和技术方面讲，属于,细胞培养,的范围,21,花药培养的基本程序,22,花粉发育时期,四分体,小孢子,单核花粉,双核花粉,最适期,23,花粉及小孢子培养,1、取材时期的确定,24,花药培养与小孢子培养的,目的,一样，为获得单倍体。,单倍体,（haploid):指具有配子体染色体数的孢子体（植物个体）,25,单倍体在育种中的作用：,加倍后可迅速获得纯合型材料，缩短育种年限,获得育种中间材料,与诱变育种相结合可以提高诱变频率，使育种途径更具有实际应用意义，无籽三倍体的获得,作为遗传工程受体更为有效,用于基础遗传学研究的各个领域,获得超雄植株（YY）,可获得异源体附加系，代换系和易位系,节省田间试验的土地和劳力,克服远缘杂交不育性与分离的困难,提高选择的正确性和效率,26,芦笋性染色体（XY）,超雄植株：有性染色体的纯合体,27,三、原生质体培养,原生质体培养：,protoplast culture,体细胞杂交,Somatic hybridization,原生质体融合,Protoplast fusion,28,相关概念,原生质体：,指除去细胞壁的细胞或是一个被质膜所包围的裸露细胞。,亚原生质体：,在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体。可以具有细胞核或没有细胞核,核质体：,由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体，即微小原生技击体,胞质体：,不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体,29,原生质体的分离和培养,无菌试管苗叶片,上胚轴和子叶,愈伤组织,培养细胞,酶解,纤维素酶和果胶酶,原生质体,原生质体培养,培养基,液体浅层培养,固体平板培养,固液双层培养,琼脂糖珠培养,培养方法,30,四、体细胞杂交,定义：,将两个不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养成植株的过程，统称为体细胞杂交（A+B）,几种不同的表述：,体细胞杂交：somatic hybridization,细胞融合:Cell fusion,无性杂交: asexual hybridization,原生质体融合：Protoplast fusion,超性杂交: Parasexual hybridization,超性融合: Parasexual hybridization,细胞工程: Cell engineering,31,1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功,1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获得再生完整植株,1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，是第一个植物细胞杂种,1974年，Kao将聚已二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并取得了相应的融合技术,1978年，Melchers获得第一个属间细胞杂交（马铃薯+蕃茄）,1981年，Zimmerman发明电融合仪，并首次年出电融合概念,1987年，Schweiger建立单对原生质体电融合技术程序,32,体细胞和有性杂交的比较,比较内容,体细胞杂交,有性杂交,时 间,无季节限制,花期限制，特别是母本的花期,亲缘关系,一定程度上可以克服有性/嫁接不亲和性,受亲和性影响,结 果,细胞核、细胞质均可以重组、倍性增加,双受精，一般无细胞质重组，倍性不改变,33,34,理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对种质资源的开发和利用具有深远意义,融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径,体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统,35,36,原生质体培养和体细胞杂交的应用,获得新品种,创造新种质,转移有利性状和克服远缘杂交的障碍,作为基因工程的良好受体及进行突变体筛选的优良原始材料,37,五、植物细胞突变体的离休筛选,基因组突变：,染色体数目的改变或细胞质基因组的增减,染色体突变：,染色体较大范围的结构变化，涉及多个基因,基因突变：,指范围在一个基因以内的分子结构的改变，按DNA改变方式有碱基置换、称雄突变、缺失突变和插入突变,（一）突变体的产生,在离体培养条件下，诱发突变的突变型和自发突变没有本质上的差别，,一般有三个水平的突变,：,38,（二）突变细胞的筛选方法,直接选择法,正选择/负选择,间接选择法,39,正选择,用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。,40,负选择,一种借助于与突变表现型有关的性状作为选择指标的筛选方法,Dorffling等以Pro类似物羟脯氨酸（HYP)为选择剂，获得了耐HYP的体细胞变异系，其抗寒性比供体亲本增强，且能稳定遗传,林定波等将锦橙株心细胞愈伤组织的悬浮细胞经射线照射，然后在高浓度散打脯氨酸培养基中培养筛选，获得了抗寒体细胞变异愈伤组织，并再生植株。鉴定显示，抗寒愈伤组织及其再生植株的抗寒性分别比供体提高1.4度和2.4度，突变系体内的Pro含量比供体增加了一倍,41,（三）突变性状遗传基础及其稳定性鉴定,遗传基础,稳定性,42,突变性状的遗传学基础,体细胞变异，除发生在染色体水平外，更多的是基因水平上的变异,从利用体细胞变异的角度，染色体变异大多是一些畸型变异，真正可利用的染色体变异十分有限,基因水平上的变异大多只是个别性状的改变，不会影响再生植株的正常生长发育。因此，从再生植株的 这些变异中有可能筛选有益的变异。,基因水平的变异从根本上讲是DNA大项突变或修饰状态的改变,43,突变性状的稳定性,对于单基因控制的遗传性状，大多数碱基突变可以稳定遗传而且符合孟德尔遗传分离规律，这一点已在水稻、烟草和玉米的体细胞变异中得以证实。,植物的许多性状特别是经济性状均由多基因控制，对于多基因控制性状的碱基突变可能由于技术上的复杂性，目前还没有关于多基因控制性状的碱基突变报道。,44,第二节 基因工程与育种,Genetic Engineering and Breeding,45,植物基因工程：,指以类似工程设计的方法，按照人们的意志，通过一定的程序，将具有遗传信息的DNA片段，在离休条件下，用工具酶加以剪切、组合和拼接，再将人工重组的基因引物适当的植物受体中进行复制和表达的技术。,转基因植物（transgenic plants),转基因技术(transgenic technique),46,基因工程,基因枪和农杆菌介导基因转化示意图,47,基因工程基本操作步骤,目的基因的分离与鉴定,植物表达载体的构建,植物的遗传转化,转化植物细胞的筛选及转基因植物的鉴定,48,植物基因转移的过程,49,基因工程在植物育种中的应用,改良品质,提高抗病虫能力,改良抗逆性,提高光合作用和固氮效率,创建雄性不育材料,延迟成熟与保鲜,选育抗除草剂品种,50,1. 提高抗病能力,抗真菌基因工程途径,抗细菌基因工程途径,克隆并导入几丁质酶基因和-1，3-葡聚糖酶基因,克隆并导入抗毒素,过量表达法,克隆转化溶菌酶基因或杀菌肽基因,51,过量表达来自番茄PR蛋白的甜橙抗脚腐病,52,马铃薯抗菌肽基因工程,53,2.抗病毒基因工程,向植物中导入病毒外壳蛋白（CP),转移病毒的反义RNA，卫星RNA，病毒复制酶基因和核酶基因等,抗病毒番木瓜,54,3. 提高抗虫能力,导入Bt毒蛋白基因,导入蛋白酶抑制基因,利用一些昆虫毒素基因（如蜘蛛杀虫肽基因，和蝎毒素基因等）,55,4. 改善抗逆性,向植物中导入热休克基因，可提高其扩，抗热性,将深海鱼美洲拟鲽的抗冻基因通过柱头导入番茄，获得可耐受-4 -5的转基因番茄,导入脯氨酸或甜菜碱合成有关的酶的基因,如甜菜碱醛脱氢酶（BADH)基因导入烟草，草莓和水稻后，转基因植物的耐盐性明显提高,56,深海鱼美洲拟鲽,转深海鱼美洲拟鲽的抗冻基因草莓,57,5. 选育抗除草剂品种,把除草剂作用的靶酶或靶蛋白质的基因导入植物,现已在矮牵牛、烟草、番茄、马铃薯、大豆、油菜、杨树等植物上获得抗除草剂的转基因植株。,转移一种能以除草剂为底物的酶的基因,如bar基因编码PPT乙酰转移酶，导入烟草，番茄和马铃薯等植物后，使作物获得抗除草剂PPT的能力,58,6. 延迟成熟与保鲜,改变果实细胞壁降解酶活性,抑制成熟激素乙烯的生成,乙烯生成减少70%,需更长时间软化,硬度：高于CK,比CK耐贮藏,转基因苹果,59,转基因耐贮藏番茄,60,7. 提高产量,目前已克降出许多种参与光合作用的基因和导致植物雄性不育的基因,Worral等报道用编码-1，3-葡聚糖水解酶基因转化烟草，矮牵牛获得雄性不育植株,提高光合作用效率和固氮效率,克隆与杂种优势相关的植物雄性不育有关的基因,61,8. 改良品质,将人工合成的富含必须氨基酸的DNA片段导入马铃薯，能有效地改善马铃薯贮藏蛋白的氨基酸成分,通过导入淀粉粒结合的淀粉合成酶的反义RNA基因，可改变马铃薯支链淀粉和直链淀粉的比例,62,9. 提早开花结实,63,转基因植株的筛选,形态学鉴定,直接选择法,间接选择法,同工酶测定,分子标记,方法：,64,第三节 分子标记辅助育种,分子标记,遗传标记,65,分子标记在育种中的应用,构建遗传图谱,分析亲缘关系和植物的起源演化问题,农艺性状基因的定位,分子标记辅助选择,种质资源及品种鉴定,66,遗传图谱和物理图谱,玉米的连锁遗传图,67,