生物药物的分离纯化

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/3,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2020/11/3,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,生物药物的分离纯化,生物药物的分离纯化生物药物的分离纯化,主要讲授内容,1.,生物药物原料的选择、预处理与保存方法,2.,生物药物的提取,3.,蛋白质类药物的分离纯化方法,4.,核酸类药物的分离纯化方法,2020/11/3,2,5.,糖类药物的分离纯化方法,6.,脂类药物的分离纯化方法,7.,氨基酸类药物的分离纯化方法,2020/11/3,3,1.1,生物药物原料的选择,生物药物生产原料的选择原则主要是：,(1),有效成分含量高，原料新鲜,；,(2),原料来源丰富，易得，原料产地较近,；,(3),原料中杂质含量少,；,(4),原料成本低等,。但是，同时具备这,4,种有利因素的原料不多，生产研究者可酌情选择，但第一条是最重要的。,2020/11/3,4,原料的选择还要注意如下事项：植物原料要注意,植物生长的季节性,，选择最佳采集时间；微生物原料要注意,微生物生长的对数期长短,；动物原料有的要注意动物的,类别,、,年龄,与,性别,。,也应注意原料的,采集地,和,批次,。,2020/11/3,5,1.2,原料的预处理与保存,动物原料,采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存；,植物原料确定后,，要择时采集并就地除去没有用的部分，将有用部分保鲜处理；,收集微生物原料,时,，要及时将菌体细胞与培养液分开，进行保鲜处理。,2020/11/3,6,原料的保存方法主要有：,冷冻法,。该方法适用于所有生物原料。常用,-40,速冻。,有机溶剂脱水法,。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。,防腐剂保鲜,。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。,2020/11/3,7,2.,生物药物的提取,(1),生物组织与细胞的破碎,(2),生物组织细胞破碎后立即进行提取,2020/11/3,8,生物组织与细胞的破碎,生物药物大部分存在于,生物组织或细胞,中，要提高提取率，对生物组织与细胞的破碎过程是非常重要的,。,2020/11/3,9,常用的破碎方法有5种：,A.,磨切法,，,该法属于机械破碎方法，使用的设备有组织捣碎机、胶体磨、匀浆器、匀质机、球磨机、乳钵等。,B.,压力法,，这类方法有加压与减压两种，常用的,法兰西压釜,使用效果良好。,2020/11/3,10,C.,反复冻融法,，,该方法设备简便，活性保持好，但用时较长。,D.,超声波振荡破碎法,，,该方法破碎效果较好，但由于局部发热，对活性有损失。,E.,自溶法或酶解法,，用得较少。,2020/11/3,11,生物组织活性物质的提取要在细胞破碎后立即进行。,提取过程中,（,1,）,要根据活性物质的性质，选择提取试剂。,提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂,(,如氯仿、丙酮等,),。,2020/11/3,12,（,2,）,考虑提取溶剂的用量（料液比）及提取次数、提取时间。,（,3,）,注意提取的温度、,pH,、变性剂等因素。,这样才可以保证活性物质提取充分而且不变性。,2020/11/3,13,3.,蛋白质类药物的分离纯化方法,蛋白质类药物主要包括蛋白质、多肽和酶类等药物。它们的分离纯化方法有：,(1),沉淀法,(2),按,分子大小分离,的方法,(3),按,分子所带电荷,进行分离的方法,(4),亲和层析法,2020/11/3,14,(1),沉淀法,蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。该法的原理是使蛋白质胶体颗粒破坏，从而沉淀蛋白质。常用的有,盐析法,、,有机溶剂沉淀法,、,等电点沉淀法,、,与靶物质结合沉淀法,(,如抗体一抗原,),等。,2020/11/3,15,(2),按分子大小分离的方法,这类方法有,超滤法,和,透析法,(,即膜分离方法,),、,凝胶层析法,、,超速离心法,等。其中膜分离法可用于生物大分子物质的浓缩、分级和脱盐。,2020/11/3,16,(3),按分子所带电荷进行分离的方法,氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质。它们具有等电点，在离开等电点的,pH,时便会带正或负电荷。例如某蛋白质等电点为,7.0,，当溶液,pH,为,4.0,时，分子则带有正电荷。由于具有该性质，利用带电性质进行分离是极其有效的方法。,2020/11/3,17,利用蛋白质带电性质行分离的方法有：,离子交换柱层析法,；,电泳法,；,等电聚焦法,。,2020/11/3,18,（,4,）亲和层析法,大部分生物活性物质都有其作用的靶物质，如,酶与底物,(,或抑制剂,),、,抗原与抗体,、,激素与受体,等，它们之间有特异的亲合作用，利用该性质设计的特异层析分离技术称为亲和层析。,亲和层析分离专一性强,，操作简便，是当前应用很广泛的分离方法之一。,2020/11/3,19,亲和层析法主要包括：,疏水反应层析、金属螯合层析、免疫亲和层析、共价亲和层析、固定化染料亲和层析、特殊基团亲和层析等。,亲和层析技术大量应用于蛋白质分离和纯化。,2020/11/3,20,4.,核酸类药物的分离纯化方法,核酸类药物生产方法主要有,提取法,和,发酵法,。,提取法,生产,DNA,和,RNA,的主要技术是，先提取核酸和蛋白质复合物，再解离核酸与蛋白质，然后分离,RNA,与,DNA,。,发酵法,主要用于生产单核苷酸。,2020/11/3,21,5,糖类药物的分离纯化方法,由于各种糖类药物的性质和原料来源不同，没有统一规范的提取和纯化工艺。这里只介绍,多糖,和,粘多糖,的一般分离纯化方法。,2020/11/3,22,提取方法,非降解法,：适用于从含一种粘多糖的动物组织中提取粘多糖，提取采用的溶剂是,水,或,盐,溶液。,2020/11/3,23,降解法：,适用于从组织中提取结合比较牢固的粘多糖。例如从软骨中分离提取硫酸软骨素，就是用碱处理进行降解，又如用酶处理法可提取与蛋白质结合的多糖。,2020/11/3,24,(2),分离方法,常用的分离纯化多糖的方法是,乙醇沉淀法,和,离子交换层析法,。,2020/11/3,25,乙醇沉淀法,是从提取液中沉淀多糖的最简易方法，也适用于,分级分离,。用,4,5,倍体积的乙醇可以使任何结缔组织中的粘多糖完全沉淀。,季铵化合物,也可用于沉淀粘多糖,其原理是,粘多糖的聚阴离子,能与某些阳离子表面活性剂结合成不溶于水的盐，如十六烷基三甲基铵,(CTA),等。,2020/11/3,26,离子交换层析法：,粘多糖的聚阴离子能够很好地被阴离子交换剂吸附和分离，如,Dowex-I-X2,离子交换树脂、,DEAE-,离子交换纤维素*,等。洗脱可用,NaCl,溶液进行梯度洗脱。,注意从粗多糖中除去蛋白常用的方法有：,Sevag,法,、,三氯乙酸法,和,蛋白酶解法,。,*,二乙氨基乙基纤维素,2020/11/3,27,6.,脂类药物的分离纯化方法,(1),提取方法,脂类自然状态下是以结合形式存在的。,非极性脂是与其他脂质分子或蛋白质分子的疏水区相结合的,。因此，提取脂质药物就是,要选择适当的溶剂来破坏这种结合键,，将脂质溶解出来。常用的溶剂有组合溶剂，醇是其中的主要成分，此外还有氯仿、甲醇、水等。,2020/11/3,28,(2),纯化方法,沉淀法：,由于不同脂质在丙酮中溶解度不同，故常用它进行沉淀。,吸附层析法：,常用吸附剂有硅胶、氧化铝等。它是通过极性和离子键力等把各种化合物结合到固体吸附剂上。一般是采用极性逐渐增大的洗脱液来进行，非极性组分先流出，极性组分后流出。,2020/11/3,29,离子交换层析法：,脂质分子的存在有,非解离,和,酸式解离,两种状态。根据它们在一定,pH,条件下的解离情况，选择适当的离子交换剂可将它们提纯。如,TEAE-,纤维素*,对分离脂肪酸和胆汁酸等特别有效。,三乙氨基乙基纤维素,2020/11/3,30,7.,氨基酸类药物的分离纯化方法,氨基酸的生产方法：,蛋白质水解法,发酵法,化学合成与酶促合成法,2020/11/3,31,蛋白质水解法,：水解法有,酸,水解、,碱,水解和,酶,水解三种。用盐酸水解为常用方法，其优点是水解迅速、完全，产物全部是,L-,型氨基酸，缺点是色氨酸全部被破坏，丝氨酸等部分被破坏。碱水解法易产生消旋作用，较少应用。酶水解法水解不够完全。,2020/11/3,32,发酵法：,发酵法主要是选育特异产生某种氨基酸的菌株，经过发酵后，从培养液中提纯氨基酸。,2020/11/3,33,化学合成与酶促合成法,：,化学合成法,一般得到的是,D/L-,型氨基酸,，,需要对,这些异构体拆分；,酶促合成法,也是酶工程在医药工业上应用的一个内容，优点是技术工艺简单，转化率高，副产物少和易提纯等。,2020/11/3,34,氨基酸的分离方法：,沉淀法,吸附法,离子交换法,2020/11/3,35,沉淀法：,根据形成沉淀的原理不同分为两种：一种是依据不同,氨基酸在水中,或,其他溶剂中的溶解度差异,进行沉淀分离。另一是用,特殊试剂沉淀,某种氨基酸，如用,邻二甲苯,-4-,磺酸与亮氨酸,形成不溶性盐沉淀，再用氨水分解，使亮氨酸游离出来。,2020/11/3,36,吸附法：,这是利用吸附剂根据氨基酸吸附力的差异进行氨基酸分离的方法。苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸的分离就是利用活性炭对其吸附的原理。,2020/11/3,37,离子交换法：,氨基酸是两性电解质，在一定,pH,条件下，不同氨基酸带电性质及解离状态是不相同的，因此在离子交换剂上被吸附的强度不同。常用的离子交换剂为强酸型阳离子交换树脂，洗脱主要用,pH,梯度洗脱。,2020/11/3,38,高效分离纯化系统的采用,主要是蛋白质分离,2020/11/3,39,（,1,）固相化金属亲和层析,(IMAC),IMAC,是近十年来发展起来的一种亲和层析技术。其原理是利用蛋白质分子中的咪唑基和巯基与一些金属元素,(Cu,2+,、,Zn,2+,等,),配位结合，使蛋白质得到分离纯化。该法比传统的,凝胶过滤一离子交换法,简单,、省时，适于实验室规模纯化。,2020/11/3,40,（,2,）超扩散层析,这种层析所用介质是,Biosepra,公司生产的,Hyper-D,。该层析介质的颗粒由,刚性框架结,构中填充,官能化的软凝胶组成,。它兼备了软凝胶的,高上样量,和普通刚性介质的,高流速,。,2020/11/3,41,这种结构可使层析操作在高流速下进行而保证高上样量和高分辨率，并且无反压产生,。,Hyper-D,具有化学隋性,。,可用酸碱进行再生和杀菌,，可用于纯化免疫球蛋白、白蛋白、激素、酶、细胞培养或发酵产生的蛋白质。适用于实验室小试直至工业化大生产。,2020/11/3,42,(3),灌注层析,1987,年由,Regnier,等人发明的,灌注填料技术,使快速分离纯化生物大分子得以实现。,1989,年与之相配套的灌注系统,(BioCAD workstation),问世，给微生物制药领域的科学家提供了强有力的工具，给生物制药业带来了突破性的进展。,2020/11/3,43,它所采用的,POROUS,介质以苯乙烯基二乙烯基苯的聚合物构成，为双模式孔结构，在介质上有,80,150nm,的,扩散孔,和,600,800nm,的,贯穿孔,。它允许液体对流到分离介质的内表面，从而大大加快了分离速度。灌注层析系统可有效、快速地纯化各种蛋白质、多肽、核酸等生物大分子。,2020/11/3,44,它比传统柱快,l0,100,倍，分析一个样品只需要,0.5,3min,。日本制药公司,Otsuka,使用博大生物技术公司的,POROS-50,介质和大生产规模系统,(autopilot),生产单克隆抗体，从,320L,样品中纯化出,13g,抗体只花了,80min,，收率,95,。,2020/11/3,45,(4),其他快速分离纯化系统,streamline,扩张柱床吸附技术,：已广泛应用于,E,coli,如包涵体、胞内、细胞膜、胞外分泌和酵母、动物、杂交瘤细胞、昆虫细胞等表达的重组蛋白的纯化，也被用于单抗及天然酶的纯化。,2020/11/3,46,AKTA explorer,快速纯化开拓系统,：,能高效地纯化各种蛋白质、肽、寡核苷酸和核酸等,。系统有预编程序，放好样品，按启动按钮，系统就会完成余下的工作，如自动取样、制备适当,pH,缓冲液、选择适当的柱、再现显示分离流程和检测状况、收集峰、自动进行数据处理并打印纯化报告。设置的预编程序可从分析到小试摸索至中试生产。,2020/11/3,47,快速蛋白液相色谱,(FPLC),：,已用于蛋白质、多肽、核酸等,400,余种生物分子的纯化。利用,FPLC,发展的纯化流程可直接放大到中试或大规模生产。,2020/11/3,48,biological system,：它视为高分辨生物分子纯化而设计的层析系统。其软件充分利用了微软视窗操作系统的优良图形界面，加速了开发和优化生物分子分离流程的方案。,2020/11/3,49,Thank You,世界触手可及,携手共进，齐创精品工程,