生物药物分析与检验 氨基酸多肽和蛋白质类药品检验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,八,章,氨基酸、多肽因子和蛋白质类药品检验,基本要求：,掌握氨基酸定性鉴别的方法，熟悉氨基酸特殊杂质及安全性检查，掌握氨基酸含量测定方法，掌握多肽因子类药物的定性鉴别方法，熟悉多肽因子类药物的检查方法，掌握多肽因子类药物生物效价的测定方法，掌握蛋白质类药物的鉴别和检查方法，掌握蛋白质含量测定和效价测定方法，了解几种氨基酸、多肽因子和蛋白质药物的质量分析过程。,基本内容,第一节,氨基酸类药品检验,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,第三节,几种氨基酸、多肽和蛋白质药物的质量分析,第一节,氨基酸类药品检验,氨基酸是,治疗蛋白质代谢紊乱,、,蛋白质缺损,所引起的一系列疾病的重要生化药物，也是具有高度营养价值的蛋白质补充剂，有着广泛的生化作用和临床疗效,。,目前氨基酸及其衍生物临床应用不断发展和扩大，创制了一些新的生化药物,。,如,甲基酪氨酸,治疗,嗜铬细胞瘤,氧苯丙氨酸,用于,类癌瘤综合征,偶氮丝氨酸,治疗,白血病,乙酰羟脯氨酸,用于,治疗类风湿关节炎,第一节,氨基酸类药品检验,氨基酸为,白色晶状体,，熔点很高，多在熔融时分解，,都能溶解在强酸强碱中,，形成的盐多能溶于水。,氨基酸在,等电点,（,pI,）时,溶解度最小,，最稳定。,中性,pI,值在,5,左右。,酸性,pI,值在左右。,碱性氨基酸的,pI,值在左右。,第一节,氨基酸类药品检验,一、氨基酸的定性鉴别,旋光度、熔点、溶解度、纸层析、氨基酸自动化分析、气相色谱等均可作为氨基酸鉴别的依据。,1,、化学鉴别法,氨基酸的,鉴别最常用的方法,是根据所有氨基酸均能与,茚三酮,显蓝紫色,。,采用茚三酮显色法，中国药典（,2010,年）二部对所收载的氨基酸类药物大多采用此方法进行鉴别。,第一节,氨基酸类药品检验,茚三酮反应：,茚三酮在酸性溶液中与,-,氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氢、脱羧反应，最后生成紫色物质。,第一节,氨基酸类药品检验,2,、光谱鉴别法,（,1,）紫外吸收光谱法,在,20,种天然氨基酸中，只有,酪氨酸,、,色氨酸,和,苯丙氨酸,在紫外区有最大吸收,。,酪氨酸,的,max,275nm,苯丙氨酸的,max,257nm,色氨酸的,max,280nm,1,：酪氨酸,2,：色氨酸,3,：苯丙氨酸。,第一节,氨基酸类药品检验,这三种氨基酸可以通过,紫外吸收光谱,加以鉴别。,精密称取酪氨酸、色氨酸、苯丙氢酸各适量,。,用水制成每,1mL,含,20g,（色氨酸）、,40g,（酪氨酸）、,200g,（苯丙氨酸）,。,在波长,230,300nm,测定各氨基酸的吸收光谱,，如右图。,第一节,氨基酸类药品检验,（,2,）,红外吸收光谱图,氨基酸在红外区都有特性图谱，可以通过与标准氨基酸图谱比较作为氨基酸的鉴别依据。,所得的吸收图谱各,主要吸收峰波长,和,各吸收峰间的相互强度关系,均应与对照的图谱一致。,第一节,氨基酸类药品检验,3,、薄层色谱鉴别法,在薄层板上点样，通过与标准氨基酸对照而鉴别氨基酸。,（,1,）,薄层板的制备,第一节,氨基酸类药品检验,（,2,）十一种氨基酸,混合液,（色、蛋、亮、异亮、甘、赖、苏、缬、苯丙、组、精）与,对照液,的,制备,。,第一节,氨基酸类药品检验,（,3,）,点样、展开和显色,吸取混合液和对照液各,3L,，分别点于同一薄层板上,。,以,正丁醇,-,水,-,异丁酸,-,醋酸,（,50,50,5,7,）之上层作展开剂，进行,单向三次展开,，展开约,15cm,，每次必须,待溶剂挥发尽,后，再进行下一次展开,。,喷以,显色剂,（,吲哚醌,1g,，溶于,100mL,无水乙醇和,10mL,冰醋酸中）置,100,干燥,5,10min,至显色完全为止,。,第一节,氨基酸类药品检验,本层析系统中，由于,分离的程度,与各种,氨基酸显出不同的颜色,，可以区别十一种氨基酸。,用,茚三酮,-,硝酸钠,试剂亦能显出不同颜色的色斑，且灵敏度较高,。,第一节,氨基酸类药品检验,4,、,旋光性,除甘氨酸外，所有的天然氨基酸都有,旋光性,，且每种氨基酸的比旋度不同，因此，可以用比旋度作为氨基酸药物的鉴别指标。,第一节,氨基酸类药品检验,二、氨基酸特殊杂质及安全性检查,1,、特殊杂质检查,氨基酸原料药所含有的特殊杂质一般为一些其他种类的氨基酸,。,用,薄层色谱法,进行限量检查：将样品配成一定浓度的供试品液，取一定量供试品液稀释后作为对照液，在同一硅胶,G,薄板上，一般用,正丁醇水冰醋酸,（,3,1,1,）展开晾干后，喷,茚三酮,的,丙酮溶液,显色，规定,供试品所显杂质斑点的颜色不得深于对照液主斑点,，以此限制其他氨基酸的含量。,第一节,氨基酸类药品检验,2,、安全性检查,影响氨基酸安全用药的因素除其中的一般杂质，主要为热原的含量。,中国药典所收载的氨基酸基本上都规定了热原检查。,采用,家兔法,，将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内观察,家兔体温升高,的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。,第一节,氨基酸类药品检验,三、氨基酸含量测定,1,、茚三酮法,茚三酮法是氨基酸定量测定应用最广泛的方法之一。,当,茚三酮,在,酸性条件,下和氨基酸反应时，氨基酸被氧化分解生成醛，放出氨和二氧化碳，水合茚三酮则成还原型水合茚三酮。然后还原型茚三酮与氨，另一分子茚三酮进一步缩合生成,蓝紫色物,，最大吸收值的波长为,570nm,。,茚三酮反应为一切,-,氨基酸,所共有，反应灵敏，根据反应所生成的蓝紫色深浅，可以测定氨基酸含量。,本法可允许的测定范围是,50g,氨基酸,。,第一节,氨基酸类药品检验,2,、酸碱滴,定法,谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸,赖氨酸（,lysine,）片中赖氨酸的测定,取本品,20,片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于赖氨酸）置烧杯中，加水,25mL,，滴加氢氧化钠滴定液（），用酸度计调节至,pH,值为,，加入预先调节至,pH,值的甲醛溶液,15mL,，搅匀，再用氢氧化钠滴定液（）滴定,至,pH,值为,，并持续,30s,。,按加入甲醛液后所耗用氢氧化钠滴定液（）体积计算，每毫升氢氧化钠滴定液（）相当于的,C,6,H,14,N,2,O,2,HCl,。,第一节,氨基酸类药品检验,3,、非水溶液滴定法,中国药典、美国药典和英国药典对所收载氨基酸类药物，除,谷氨酸,用,氢氧化钠,为标准溶液的酸碱滴定法，其余均根据其结构特性，采用了,非水酸碱滴定法,。,用,冰醋酸作溶剂,，,高氯酸,作,标准溶液滴定，电位法或指示剂法确定终点。,适用于,常量氨基酸,的含量测定。,第一节,氨基酸类药品检验,4,、,定氮法,精氨酸和天冬酰胺,的原料及其制剂可以采用定氮法测定含量,。,将被测药物置于凯式烧瓶中，加浓硫酸、硫酸盐及适量的催化剂，加热进行有机物的破坏，其中所含的氮完全转化为氨，再与硫酸结合成硫酸铵，硫酸铵与强碱反应，放出氨，将其蒸出，吸收于定量酸溶液，酸碱滴定法滴定，从而计算出氮的含量并换算成被测药物的含量。,第一节,氨基酸类药品检验,5,、,HPLC,对于各种复方氨基酸制剂中氨基酸的含量测定，目前较多地采用了高效液相色谱法（,HPLC,）。,因大多数氨基酸,没有紫外吸收,，不能用紫外检测器测定。为改善被测物的检测特性，提高检测灵敏度，需进行,化学衍生化,。,衍生方式包括,柱后衍生法,和,柱前衍生法,。,柱后衍生法是将样品经离子交换柱分离后进行衍生,；,柱前衍生法是将样品制成适当的衍生物再进行,HPLC,分离,。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,蛋白质和多肽因子是生物体内广泛存在的生化物质，具多种生理功能，是一大类非常重要的生化药物。,多肽因子类药物,指分子量不算太大的，在体内含量极微，但却发挥极大生理作用的一类生物活性物质。,其中包括天然动物体内提取的药物如干扰素、白细胞介素、胸腺肽、转移因子等和通过现代基因工程技术生产的药品如重组人干扰素、重组白细胞介素、重组乙肝疫苗等。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,一、多肽因子类药物的定性鉴别,基因重组多肽因子类药物的,鉴别,主要采用,SDS-PAGE,法,和,免疫印迹法,。,1,、,SDS-PAGE,法,用,SDS-PAGE,鉴别生物样品必须是该品有,极纯的标准对照品,，通过电泳结果的对比，确定所测样品是否与标准品有,相同的迁移率,，从而鉴别该品。,缺点,：必须有标准品；,凝胶中多肽,需,保留生物活性，或能,够复性,，或电泳前可将检测配基,与待,测多肽共价交联,。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,2,、,蛋白质,免疫印迹,电泳,法（转移电泳、,western blot,）,原理,：,借助,聚丙烯酰胺凝胶,技术，将生物活性物质高效分离，分离后的样品可以,原位,、,定量驱动,或,吸印,在另一种,固相载体,（通常用醋酸纤维素薄膜，简称,NC,膜）上,，,能,保持原有的生物活性,，可以进行各种生物检测、免疫识别、扫描、积分和保存。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,（,1,）基本操作,分,3,个部分,：,聚丙烯酰胺凝胶电泳,；,转移电泳,（,即将凝胶中的多肽条带转移到硝酸纤维素纸上,）,；,检测或鉴定,薄膜上的,多肽条带,。,聚丙烯酰胺凝胶电泳,先将,待,分离样品进行凝胶电泳分离。,凝胶可用,琼脂糖凝胶,，也可用,聚丙烯酰胺凝胶,，可以是,均一,的，也可用,梯度,凝胶，凝胶缓冲体系中可含有各种,变性剂,，如,SDS,、,LDS,、尿素等，可进行,单向或双向电泳,，也可用,等电聚焦电泳,。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,转移电泳,将,湿,醋酸纤维素（,NC,）,薄膜,紧贴,凝胶,，凝胶与薄膜之间,不能有气泡,，否则在气泡所在部位的条带将不能转移，在,NC,膜和凝胶的另一侧放上,两层湿滤纸,，也,不能有气泡,，再在两边,贴上海绵,，最后用,塑料网框架,夹紧，插入,电泳槽,，根据凝胶中样品,所带电荷的性质,，决定有,NC,膜的一边是靠近,正极,还是靠近,负极,一侧。,电泳条件取决于凝胶类型、转移装置和蛋白质本身性质等。一般采用,低电压,和,低电流,（,2mA/cm,2,以内,）。,缓冲液中一般含有,20,的甲醇或乙醇,，其作用主要是保持凝胶的几何形状。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,检测或鉴定,NC,膜,借助,非共价键,吸附蛋白质,，经转移后蛋白质条带就固定在,NC,膜上，,完全保留,凝胶中的,蛋白谱,，可,直接,用考马斯亮蓝、氨基黑,10B,等,染色,。,如果利用蛋白质生物活性，或用蛋白质生物探针来检测，就要,先用,1,3,的牛血清蛋白,或血红蛋白，或,非离子去垢剂,（吐温,-20,）等,处理,NC,纸,，,以封闭,NC,纸上未吸附蛋白质区域，使其不再能吸附蛋白质。,使用非离子去垢剂比较经济，但有可能把,NC,纸上的某些蛋白质洗掉，同时还要将,NC,纸反复洗涤以去除变性剂，,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,二、多肽因子类药物的检查,1,、分子量检查,常用还原型,SDS-PAGE,法检查分子量，用量约,1g,。,也可采用,凝胶过滤法，例如,Sephadecx,系列（,G-75,，,-100,）,；,waters 1,60,，,125,，,250,；,Backman TSK 2000SW,，,3000SW,，,4000SW,。,凝胶过滤,是测定,完整蛋白质分子,的分子量，而,SDS-PAGE,是测定,蛋白质亚基,的分子量，,同时,用这,二种方法,测定同一蛋白质的分子量，可以方便地判断样品蛋白质是否是寡聚蛋白质。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,2,、等电点测定,等电点是蛋白质的物理化学常数，它表示蛋白质的带电性质。,一般采用,凝胶等电聚焦电泳,技术测定等电点。,3,、紫外吸收,不同的蛋白质分子都有其特定的紫外吸收，对于某种蛋白质或多肽来说，它的,最大吸收波长是固定,的。,紫外吸收光谱,是检查蛋白质的一个重要指标。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,4,、纯度,基因工程产品蛋白质,纯度,是一项重要指标，但它也是一项相对的指标，需,根据实际要求而定,。,蛋白质纯度,一般是指,是否含有其他杂蛋白,，而不包括盐、缓冲液离子、,SDS,等小分子在内。,目前较常用的是,HPLC,法,（包括凝胶过滤、各种反相,HPLC,、离子色谱、疏水色谱等）、,非还原,SDS-PAGE,凝胶电泳法,、,毛细管电泳法,（,CE,）、,等电聚焦电泳,，,此外也应用一些化学方法，观察末端是否均一。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,至少应用两种以上的方法，而且是,两种不同分离机理,的方法来判定蛋白质的纯度才比较可靠。,常发现某一样品在凝胶过滤中是纯的，而在离子色谱中却分辨为二个组分，反之亦然。,又如一种样品用,凝胶过滤法,和,SDS-PAGE,电泳,证明是纯的，但这仍不充分，因为这,两,者,机理相同,。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,三,、蛋白质类药物的鉴别和检查,1,、蛋白质类药物的鉴别,蛋白质类药物可根据其各自的物理、化学性质、生理作用等采用不同的方法进行鉴别。,（,1,）,茚三酮反应,组成蛋白质的氨基酸都能与茚三酮反应生成紫色化合物，因此蛋白质也有此反应，这是蛋白质鉴别的最常用方法。,（,2,）,福林酚反应或双缩脲反应,这两种常用来测定蛋白质的含量，但有时也用于蛋白质的鉴别。,（,3,）,紫外吸收,由于组成蛋白质的氨基酸中，酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸在紫外区的光吸收特性，因此可利用此种特性鉴别蛋白质。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,五、蛋白质含量测定和效价测定,1,、蛋白质含量测定,蛋白质的定量可用化学方法如,凯氏定氮法,、,双缩脲法,、,福林酚法,、,紫外光吸收法,来测定；也可用,染色法,，如,氨基黑,、,考马斯亮蓝,测定；此外还可用,荧光激发,、,氯胺,T,、,放射性核素计数,等灵敏度较高方法。,上述方法中凯氏定氮法、福林酚法、紫外光吸收法最为常用，它们操作简单、设备便宜。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,（,1,）凯氏定氮法,凯氏定氮法常用来测定有机物的含氮量。,原理：,A,、,含氮有机物,的消化,当,含氮有机物与硫酸共热,时，分解出氮、二氧化碳、水。,氮转变出的氨与硫酸化合生成,硫酸铵,。,分解反应进行得很慢，可加入,硫酸铜,及,硫酸钾,或,硫酸钠,促进反应，其中,硫酸铜为催化剂,，硫酸钾或硫酸钠可提高沸点。,过氧化氢,也能加速反应。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,B,、,铵离子的生成,消化完了以后，在凯氏定氮瓶中加入,强碱（氢氧化钠溶液）消化液,，使硫酸铵分解，放出氨。,用,水蒸汽蒸馏法,，将氨蒸入过量的,硼酸,溶液中，氨与溶液中的氢离子结合，生成,铵离子,，使溶液中氢离子浓度降低。,C,、,测定,用,强酸滴定,，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。,所用强酸的摩尔数即相当于被测样品中氨的摩尔数,。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,（,2,）紫外吸收法,280nm,光吸收法,由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的,苯环,含有共轭双键，因此蛋白质在,275,280nm,波长处有一个紫外吸收高峰，在一定范围内，蛋白质溶液在,280nm,波长处的光吸收度值（,A,280,）与其浓度成正比，因此可作定量测定,。,该法测定范围为,。,该法简单、灵敏、快速、不消耗样品，,低浓度的盐类不干扰测定,，因此在蛋白质和酶的生化制备中广泛应用。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,280nm,和,260nm,光吸收差法,若样品中含有,嘌呤,、,嘧啶,等核酸类吸收紫外光的物质，在用来测定蛋白质浓度时，会有较大的干扰。,由于核酸在,260nm,波长处的光吸收比,280nm,波长处更强,，因此可利用,280nm,和,260nm,的吸收差来计算蛋白质浓度。,常用下列经验公式估算：,蛋白质浓度（,mg/mL,）,A,280,A,260,（假设,1mg/mL,蛋白质溶液的,A,280,为）,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,（,3,）,考马斯亮蓝,G-250,染色法,考马斯亮蓝,G-250,在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过,疏水作用,结合后变为,蓝色,，可在,595nm,波长处进行比色测定,。,该法反应快、操作简便、消耗样品少，但不同蛋白质之间差异较大，且,标准曲线线性较差,。,测定范围为,蛋白质,。,高浓度的,Tris,、,EDTA,、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去垢剂对测定有干扰，缓冲液浓度过高或改变测定液的,pH,也会影响显色。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,A,、,溶液的配制,标准蛋白质溶液或牛血清白蛋白。,染色液,称取,100mg,考马斯亮蓝,G-250,溶解于,50mL 95,乙醇中，加,100mL 85,的磷酸，加水稀释到,1000mL,。该染色液可保存数月。若不加水可长期保存，临用前再稀释。,B,、,标准曲线,在试管中分别加标准蛋白质溶液,0,、,6,、,12,、,24,、,36,、,48,、,60L,，用水补足至,60L,，加,3mL,染色液，混匀后在室温（,20,25,）保温,15min,，在,595nm,波长处进行比色测定，以标准蛋白质浓度为横坐标，以吸收度值为纵坐标作标准曲线。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,C,、,样品测定,取,60L,样品溶液同上测定，然后从标准曲线上查得其浓度。,当样品中蛋白质浓度较稀时（），可在,3ml,染色液中加样品溶液，同时作标准曲线，测,595nm,波长处的光吸收度值。,牛血清白蛋白溶液的,A,595,约为。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,2,、蛋白质的效价测定,蛋白质的效价测定较多地采用,生物检定法,。,（,1,）,小鼠血糖法,测定,胰岛素效价,在给小鼠注射胰岛素后，以其,降低血糖,为反应指标，用适宜的方法如,葡萄糖氧化酶,过氧化酶法测定血糖值,，能直接反映其降血糖的药理作用。,此法用动物少并为微量反应，反应指标更接近于临床，设备简单、操作方便，,克服了,小鼠惊厥法判断指标易受主观因素影响,、,实验误差较大,、,专属性差且需特定的恒温设备等缺点。,第二节,多肽因子类和蛋白质类药品检验,（,2,）,HPLC,法分析蛋白质和多肽,HPLC,技术已发展为检测蛋白质结构和纯度的重要分析工具。,Smith,用,RP-HPLC,法测定了胰岛素效价,，大大缩短了分析时间，样品用量少，同时还能获得对胰岛素纯度评估必不可少的杂质种类及含量信息。,李湛君等对比了,RP-HPLC,法,和,在体生物测定法,（小鼠血糖法），证明两种方法测定,结果基本吻合,，,差异无显著性意义,。,在高纯、单峰胰岛素产品的质量控制中，理化方法可代替生物测定法。,BP,和,USP,对人胰岛素的鉴别和效价测定及其中的高分子蛋白、脱氨胰岛素和相关蛋白的限量测定，均采用,HPLC,法。,