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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Q&A,关于PCR结果分析,关于产物回收漂洗作用：换缓冲液，除杂乙醇：保存目的产物离心：去乙醇，除液体，保证后续工作补救：勿轻易弃置； 高盐结合，重复漂洗。,关于,1,1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12,Fig. 1 Agarose Electrophoresis analysis of the PCR products.,Lane 1Lane 12：products of PCR M：DNA marker （from top to bottom：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）,引物或其二聚体,问题：,10泳道：上样错位？错误模板？引入污染？热启动不够？ 回收，重新电泳鉴定。,1、12泳道：未加引物或模板。,2,相邻泳道溢出污染,非特异性！,Good,！PCR仪中的位置,3,边缘效应？,4,！,5,胶融！外溢,胶融！,6,质粒DNA的提取及其定性定量分析,基因的克隆与表达专题之二,7,主要内容,一、质粒,DNA,提取,二、琼脂糖电泳鉴定及半定量,三、紫外吸收定量及纯度检测,8,基本原理,结构差别,分子量差别,变性复性,SDS碱裂解,9,碱裂解,碱变性,一、质粒DNA的提取流 程,接含pETBlue-2(质粒的单菌落于4mL LB 羧苄（50ug/mL ）和四环素（12.5ug/mL）液体培养基中,37,0,C，190rpm振荡培养过夜,4000rpm、离心1min，收集所有菌体,150uL溶液I悬浮菌体（旋涡混匀），室温10min,加入200uL溶液II（轻轻混匀!），室温静置菌液裂解变清,接菌,培养,收菌,碱裂解,10,加入200uL溶液III（,轻轻混匀!,），冰上静置15min质粒DNA复性,12000rpm，离心10min,上清加,等体积,的酚：氯仿：异戊醇（,旋涡混匀,）,12000rpm，离心5min,上清加,等体积,的氯仿：异戊醇（,旋涡混匀,）,12000rpm，离心5min,复性回收,纯化,11,上清加2倍体积的无水乙醇（,旋涡混匀,），室温 30min,12000rpm，离心10min,沉淀用75%乙醇1mL洗涤两次（,振荡混匀、离心,）,12000rpm，离心5min,沉淀于超净台中风干,（5min20min）,沉淀加入20uL RTE，60,0,C水浴30分钟溶解,-20,0,C保存,醇沉回收,溶解,保存,离心标识,12,碱裂解,溶液,冰浴,pH 8.0,剧烈振荡,10,min,溶液粘稠混浊,13,碱裂解,溶液,现用现配,切勿振荡！颠倒混匀,T 5min,SDS,包被,！,14,复性回收,溶液,冰上预冷,切勿振荡！颠倒混匀,15,min,仅质粒复性？在哪相？,！,15,制 胶：,1%,琼脂糖（,20,mL,，,1xTAE),缓冲液：,1,xTAE,，,130,mL,制 样：质粒,DNA 2L 10xloading 0.5L,Marker,：,5L,电 泳：,80,伏恒压,结果分析：鉴定（定性，纯度）；半定量,二、质粒DNA的电泳,16,测定流程：质粒,DNA,稀释,100,倍（用,TE,缓冲液稀释），总体积300, L,检测波长：,定量：,C=OD,260,*50*,稀释倍数（,g/,mL,）,纯度指标：,三、质粒DNA的紫外吸收检测,260nm核酸280nm蛋白,OD,260,/OD,280,比值范围：1.82.0,污染成分：蛋白,酚 质粒DNA RNA,17,下次实验的简介与准备,18,DNA 重 组酶切和连接,基因的克隆与表达专题之三,19,预习：在实验中如何进行对照？,思考：工程菌的常用种类及用途？ 质粒的种类及特性？ 分子生物学中常用的内切酶？连接酶？ 抗生素种类？为什么应用抗生素？,灭菌：,1,mL,、,200,L,、,10,L,枪头各一盒,1.5,mL,小指管,40,个,20,加油啊！,21,2000,1000,750,500,200,100,M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 C,关于PCR退火条件摸索,22,
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