Taqman探针及SYBR Green I荧光染料技术

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,半定量,RT-PCR,原理,半定量,RT-PCR,是指通过总,RNA,逆转录为,cDNA,后，扩增目标,cDNA,和内参,cDNA,，通过,PCR,产物量推测样品中特异,mRNA,的相对数量。内参是基因组中保守的,DNA,序列，其表达恒定，因此在总,RNA,中所占的比例是大致恒定的。目标基因在受到处理因素影响后，其表达量一般有所改变。这样扩增后目标产物与内参产物量的比会有所变化，可以说明目标基因的表达量的改变，做到半定量！内参一般选用如：,-actin,（,肌动蛋白），,GAPDH,（三磷酸甘油醛脱氢酶）等,步骤：,1.,抽提,RNA,，,2.,反转录获得,cDNA,，,3.,以,cDNA,为模板做,PCR,注意： 步骤,1,，,RNA,抽提质量一定要好，注意污染。内参的选择，常用的有,actin,和,GAPDH,俩中。步骤,3,，半定量,RT-PCR,应该再两管中进行，既内参和目的基因各一管，这样便于控制，做图的时候可以放在一各泳道里跑！指数期和平台期一定要摸清楚！,半定量,RT-PCR,步骤,TaqMan,探针法是高度特异的定量,PCR,技术，其核心是利用,Taq,酶的,35,外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。 在,TaqMan,探针法的定量,PCR,反应体系中，包括一对,PCR,引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的,5,端标记有报告基团,(Reporter, R),，如,FAM,、,VIC,等，,3,端标记有荧光淬灭基团,(Quencher, Q),，如,TAMRA,等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着,PCR,的进行，,Taq,酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其,35,外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号（图,4,）。所以，每经过一个,PCR,循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板,DNA,的拷贝数。,TaqMan,探针法,TaqMan,探针法,TaqMan,探针根据其,3,端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种：普通的,TaqMan,探针和,TaqMan MGB,探针。,MGB,探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团,(Non-Fluorescent Quencher),，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有,MGB (Minor Groove Binder),修饰基团（图,5,），可以将探针的,Tm,值提高,10C,左右。因此为了获得同样的,Tm,值，,MGB,探针可以比普通,TaqMan,探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的,DNA,碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。实验证明，,TaqMan MGB,探针对于富含,A/T,的模板可以区分得更为理想。,TaqMan,探针法,TaqMan,探针法,SYBR Green I,荧光染料技术原理,SYBR Green I,是一种只与,DNA,双链结合的荧光染料（图,6,）。当它与,DNA,双链结合时，发出荧光；从,DNA,双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链,DNA,分子的数量。,SYBR Green,荧光染料法定量,PCR,的基本过程是：,1,、开始反应，当,SYBR Green,染料与,DNA,双链结合时发出荧光。,2,、,DNA,变性时，,SYBR Green,染料释放出来，荧光急剧减少。,3,、在聚合延伸过程中，引物退火并形成,PCR,产物。,4,、聚合完成后，,SYBR Green,染料与双链产物结合，定量,PCR,系统检测到荧光的净增量加大。,SYBR Green I,荧光染料技术,SYBR Green I,荧光染料技术,SYBR Green I,荧光染料能与所有的,DNA,双链相结合，对,DNA,模板没有选择性，所以特异性不如,TaqMan,探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对,PCR,引物设计的特异性和,PCR,反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是一种成本低廉的选择。,常规,PCR,仪,实时定量,PCR,仪,