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单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,生化技术Biochemical Technique,1,一.什么是生化技术？,生化技术是研究,生物体,的化学,组成、结构、功能,以及在生命活动中化学物质的代谢、调节控制等的,实验方法,。,2,内容：,生物大分子的一般制备,分子生物学的基本操作,3,分离纯化检测生物大分子,电泳 Electrophoresis 层析 Chromatography 离心 Centrifugation 检测 光谱分析法,分离,4,二.生物大分子的一般制备法,体液： 直接分离生物样品 组织细胞：先破细胞,分离,检测,5,生物大分子制备的四个阶段,选择材料和预处理,组织细胞的破碎及细胞器的分离,生物大分子的分离纯化,浓缩、干燥和保存,6,（一）材料选择和预处理：,微生物,植物,动物,7,（二）组织细胞破碎的方法：,1.物理方法： 玻璃匀浆器(homogenizer),8,研钵（加净砂或玻璃粉）,9,高速组织捣碎器,10,超声波,11,渗透压法 反复冻融法,12,2.化学方法,有机溶剂（破坏细胞膜的脂质 双分子层）,3.酶法,自溶法（蛋白酶、酯酶） 酶解法（溶菌酶破坏细胞壁的,-1，4-糖苷键）,13,（三）生物大分子的分离、纯化,以蛋白质为例,【提取】相似相溶,1.水溶液的提取 中性盐溶液提取： 缓冲液提取：2.有机溶剂提取,14,【分离纯化】1.根据蛋白质溶解度不同的分离方法：（1）盐溶与盐析,（Salting in & Salting out),蛋白质、酶及其它们与其它物质的复合体在离子强度低的盐溶液中，其溶解度随着盐溶液浓度的升高而增加，此现象称为,“盐溶”,。,15,当溶液中盐浓度不断上升，达到一定程度，蛋白质等的溶解度反而逐渐减小，并先后从溶液中析出，称为,“盐析”,。,16,盐析作用的产生,由于盐离子同水分子发生水合作用， 造成盐离子与蛋白质分子争夺水分子， 减弱了蛋白质的水合程度。,蛋白质表面的电荷被盐溶液中对应的 离子中和，其水化膜层被破坏，使蛋 白质等的溶解度下降，蛋白分子相互 聚集而沉淀析出。,17,中性盐的选择,硫酸铵 (NH,4,),2,SO,4,硫酸钠 Na,2,SO,4,18,例：分离球蛋白和白蛋白 血清1ml 1ml PBS充分混合。 逐渐加入饱和(NH,4,),2,SO,4,溶液至50%，边加边搅拌。 离心 上清 沉淀（球蛋白）,19,（2）等电点沉淀法（溶解度最小）,PI MW,Alb 4.86 66 000,1 5.02 130 000,2 5.02 200 000, 5.12 1 300 000, 6.87.3 1 500 000,20,（3）低温有机溶剂沉淀法,甲醇、乙醇、丙酮使多数蛋白质溶解度降低 并析出。,脱水、介电常数小,分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在 低温下进行。,（4）聚乙二醇沉淀法,21,2.根据蛋白质分子大小不同的 分离方法：,22,（1）透析和超滤,（Dialysis & Ultrafiltration)透析：,利用溶液组分能否通过半透膜并由引起膜两边溶液的化学势能不同，而达到去除溶液中的小分子物质。,超滤（反向渗透）,利用压力或离心力，迫使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质不能透过半透膜仍留在膜上。,23,（2）凝胶层析法（Gel Chromatography),利用各种物质分子大小不同，在固定相上受到阻滞程度不同而达到分离的一种层析方法。,（3）SDS-PAGE,24,3.根据蛋白质带电性质差异的分离方法：,醋酸纤维素薄膜电泳 琼脂糖凝胶电泳电泳法 聚丙烯酰胺凝胶电泳 等电聚焦电泳离子交换层析法,25,醋酸纤维素薄膜电泳,血清蛋白质的分离 分子量 pI白蛋白 66000 4.861球蛋白 130000 5.022球蛋白 200000 5.02球蛋白 1300000 5.12球蛋白 1500000 6.8-7.3,26,+,白蛋白,1,2,加样,27,+,28,清蛋白Alb,2,1,+,29,30,琼脂糖凝胶电泳,从海藻中提取出来的一种线状高聚物，由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖组成三维空间结构。,31,分离血浆脂蛋白,脂质 蛋白质 直径,CM 98% 2% 100 VLDL 90% 10% 75 LDL 70% 30% 20 HDL 50% 50% 10,32,加样槽 前 ,CM LDL VLDL HDL,+,33,+,34,聚丙烯酰胺凝胶电泳,（1）丙烯酰胺结构式,35,（2）亚甲双丙烯酰胺,36,37,等电聚焦电泳,载体两性电解质,38,39,离子交换层析法,40,41,4.根据配体特异性的分离法： 亲和层析,42,5.根据被分离分子的密度 -离心技术,43,【鉴定】,检测-光谱分析法 RNA & DNA 260nm 蛋白质 280nm,44,（四）浓缩、干燥、保存,样品的浓缩,1、减压加温蒸发浓缩,2、空气流动蒸发浓缩,3、冰冻法,4、吸收法,5、超滤,45,干燥,真空干燥,适用于不耐高温，易于氧化物质的干燥和保存。,冷冻干燥在相同压力下，水蒸汽压力随温度下降而下降，故在低温低压下，冰很易升华为气体。,46,保存,1、干燥制品的贮存,2、液态贮存,样品不能太稀,一般需加入防腐剂、稳定剂,低温贮存,47,三、 分子生物学技术,重组DNA技术的基本步骤,1.目的基因的获得2.目的基因与载体的连接3.重组DNA分子导入受体细胞4.筛选出含重组DNA基因分子的受体细胞克隆5.克隆基因的表达及表达产物的检测和分离,DNA的提取：组织、细胞、质粒RNA的提取：组织、细胞PCR技术：常规PCR、RT-PCR限制性内切酶Western blot,48,四.生化技术的特点：,1.条件温和 2.实验条件与机体内环境尽 量符合,49,五.生化技术的应用：1.工业、农业研究、生产2.生化研究3.临床应用、诊断,50,六.发展趋势：超微量高效自动化快速综合联用 比色- 计算机,51,小结：,1、掌握生物大分子的制备分离纯化的方法；,2、熟悉生化技术的定义和特点；,3、了解生化技术的应用发展趋势。,52,思考题：,1、常用组织细胞破碎的方法有哪些？,2、请列举生物大分子分离纯化的方法，并分别简述其原理。,53,参考书目：,赵永芳主编生物化学技术原理及其应用第二版；第三版,54,
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