基因工程实验

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,2011基因工程实验,食品学院,1,实验一：碱裂解法抽提,质粒DNA,2,一、实验目的,学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法。,3,二、实验原理,碱裂解法主要利用共价闭合环状质粒和线性染色质在拓扑学上的差异。,NaOH和SDS溶液使细胞裂解，在碱性溶液中，线性的大分子量细菌染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离。,4,当加入中性缓冲液调和时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，而染色体DNA不能复性，它们之间交联形成不溶性网状结构，并与细胞碎片、蛋白质、SDS等结合沉淀下来。,通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质等可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA消除。再用酚氯仿处理，可除残留蛋白质,5,三、材料、试剂及仪器,1 材料：,（1）菌种E.coliDH 10B含质粒pSK,（2）菌种E.coliDH 10B含质粒pMP3,2 试剂:,LB培养基（ 固体和液体）;氨苄青霉素(Amp,100mg/ml);20SDS;溶液; 溶液,（最好现配现用）;溶液（-20预冷）; 4N NaOH; 3MNaAc（PH5.2）;无水乙醇; TE缓冲液（PH8.0）; RNaseA(10mg/ml); 70乙醇;饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）,6,3 仪器及设备,高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、漩涡振荡器,培养用试管、量筒、冰盒、微量离心管、微量取液器、吸管头若干,7,四、实验步骤,1.细菌的培养,（1）配制LB液体和琼脂培养基，并高压灭菌,（2）当培养基不烫手时把Amp加入琼脂培养基中倒平板使终浓度为Amp100,g/ml,（3）,在Amp100,g/ml的琼脂培养基平板上用接种环划线分别培养出含mp3和psk质粒的大肠杆菌的单菌落（37,.18-20个小时,）,（4）取2支灭菌的12mL培养管，加入2.5mL液体LB培养基和2.5LAmp母液（1000x）,（5）用灭菌的镊子夹一个灭菌的牙签，在单菌落上沾一下放入液体培养基中,（6）盖上盖子，将培养管倾斜插在摇床上，37过夜培养（ 200rpm，14-16小时，一般不超过18小时）。,8,2 质粒DNA的提取,取,1.5 ml,菌液入,1.5ml,的离心管中,5000rpm、离心2min，弃上清，收集菌体（如果想提取多一点DNA，再吸取1.5ml菌液到同一离心管中，离心，弃上清）:离心时离心管方向要固定，柄朝外，方便看是否离下来,用移液枪尽可能除去上清液，然后150uL溶液I悬浮菌体,用涡旋振荡器充分振荡 ：溶液I最好要放冰上,加入250uL溶液II，缓慢上下翻转离心管10多下，,温和,混匀,，冰上静置5min ：充分裂解菌体,9,加入180uL预冷的溶液III，上下翻转十多下，温和混匀，冰上静置10min或者放入-20冰箱5min :,使染色体DNA等沉淀，而质粒DNA复性,12000rpm，4离心5min。,取上清。加2/3体积的酚/氯仿12000rpm，混匀。12000rmp离心5min ：,用于抽提脂类，蛋白质等。,在混匀时，要盖紧盖子，用纸巾包住离心管，来回翻转。离心后会发现溶液分三层，上层为含DNA，RNA的水相，中间为蛋白质，下层为有机相,移取上清液，加2倍体积的无水乙醇（大量提取时可以用0.6倍的异丙醇代替），混匀：用于沉淀DNA，,10,12000rpm离心5min，倒掉酒精。离心几秒钟，用移液枪尽可能除去酒精。用0.5ml 70%酒精洗DNA一次，离心2min，倒掉酒精,70%酒精可以使DNA保持不溶解的状态，30%的水还可以使离子洗去,离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干十分钟,此时DNA变成无色透明,加入50ulTE（含50ug/mgRNaseA）溶解DNA沉淀。放置金属浴65加热10min或37放置数小时,使RNaseA发挥作用，并且DNA酶在此条件下会失活,-20保存备用,11,3 质粒DNA的进一步纯化,加入TE使DNA溶液为200ul，加入等体积的酚/氯仿，充分振荡：会分三层,12000rpm，离心5分钟，吸取上清液,加入等体积的氯仿， 12000rpm，离心5分钟，取上清,加入1/10体积的3MNaAc，加2倍体积的预冷的无水乙醇，混匀。,置于-70冰箱约10min以上或者-20冰箱30min至数个小时,12,12000rpm离心15分钟（4,），倒掉酒精，离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精,用0.5ml70,%酒精洗DNA沉淀一次，离心2分钟，倒掉酒精,离心几秒，用移液枪尽可能除去酒精，风干。,加30ulTE溶解DNA沉淀（TE不加RNase）,13,五、实验注意事项,1 挑菌落应挑单菌落。,可用牙签挑取，也可用tip头挑取。市场上买的牙签上有防腐剂，应用沸水煮过之后，烘干用,2 细菌培养过程应注意保持细菌的通气性：,（1）培养基的体积不能占培养管的体积太多,（2）培养管的体积不用盖太紧,（3）培养管倾斜培养：可增大细菌与氧气接触面积,（4）转速为200rmp：快一点的转速有利于保持其的通气性,14,3 细菌培养后可通过肉眼观察分辨是否有杂菌：大肠杆菌的应为乳白色或淡黄色，有杂菌的会发红,4 氯仿有毒性，见光会产生有毒光气，所以要保存于棕色瓶里，任何涉及氯仿的操作都要在通风厨内使用。并且氯仿会溶解塑料，吸取时把离心管靠近些,RNaseA,可加入,TE,中，也可加入,Solution,中,加入溶液,、溶液,摇匀时一定要温和，不能剧烈摇动,15,六、思考题,1 为什么真核生物基因组DNA不能用碱法抽提？,答：碱法提取质粒是,利用共价闭合环状质粒和线性染色质在拓扑学上的差异。当线性的基因组DNA遇到强碱后，产生不可逆的变性，而质粒DNA由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开，当条件适合时，质粒DNA又恢复了原来的结构。,真核生物的基因组DNA为双螺旋结构，在在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，双螺旋结构遭破坏而发生变形，而基因组DNA分子量相对较大，在碱性PH条件下其线性的大分子量基因组DNA不能复性，而形成缠连的网状结构与蛋白质等共沉淀。,16,2 异丙醇和无水乙醇对核酸沉淀的优缺点,答：,异丙醇和乙醇都能与与任意比例的水相混合。异丙醇比较疏水，能很更好地沉淀核酸，乙醇可以去盐，它比异丙醇更亲水，所以能去掉一些盐离子。,异丙醇沉淀量多，但杂质也多，增加了后续实验风险。,其优点为：,所需容积小且速度快，适用于浓度低，而体积大的DNA样品的沉淀。一般不需要在低温条件下长时间放置。,缺点为,：易使盐类（如NaCl、蔗糖）与DNA共沉淀；在DNA沉淀中异丙醇难以挥发除去 乙醇是沉淀DNA乙醇是首选的有机溶剂，对盐类沉淀少，DNA沉淀中所含的衡量乙醇易蒸发去处，不影响以后的实验。在适当的盐浓度下，2倍样品容积的95乙醇可有效沉淀DNA。,其缺点,是总体积较大。需在-20放置很长时间，30分钟-1小时，同时DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶解损失,17,3,核酸沉淀时为什么要加高浓度盐（ NaAc）？,答：在pH为8为左右的溶液中，分子是带负电荷的，加一定浓度的或，使中和分子上的负电荷，减少分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分形成钠盐而聚合，这样就造成沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的中，由于过多的盐杂质存在，影响的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀,18,实验二 琼脂凝胶电泳,19,一、实验目的,学习琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理和方法，并掌握检测质粒DNA的纯度、浓度与分子量的方法,20,二、实验原理,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45开始形成多孔行滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。,DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。不同DNA，其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。,溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5ng以上的DNA。本实验用的显色剂为Golden view,原理与EB相似。,质粒DNA有环状超螺旋、开环、和线性，电泳迁移率为超螺旋线性开环。,21,三、实验材料、试剂和仪器,1 材料,试验一提取的质粒pSK和MP3,2 试剂,琼脂糖、10xTBE 电泳缓冲液。10x载样缓冲液、EB母液（0.5mg/ml）、DNA(Hind,）,3 仪器与用具,微波炉，电泳仪，微型电泳槽，凝胶成像系统,微量取液器、吸管头若干、加样板、量筒、三角瓶,透明胶带,22,四、 实验步骤,一、制胶,1、称取1g琼脂糖加入盛有100ml 0.5TBE电泳缓冲液的5000ml三角瓶中，摇匀，用电子天平称三角瓶的总重量。在微波炉或者电炉上加热至琼脂糖完全溶解，放在天平上加蒸馏水至原重量。冷却到约60后，加入5ul的Goldview（终浓度0.5ug/ml），并摇匀。,2、插入适当的梳子到制胶板,将溶解的琼脂糖倒入其中，直至厚度约4-6mm。,3、冷却至室温:待成形后可放入冰箱内（4,10min),加速凝固,4、充分凝固后拔出梳子，用镊子撬开凝胶，要保证点,样孔完好,5、将凝胶放入电泳槽中，加电泳缓冲液,至液面覆盖凝胶1-2mm,23,2.,点样,1xTE或ddH,2,O:7L,10ul混合液 10xloading buffer : 1ul,样品:2 ul,混合后点入点样孔中。其中最左边的两个孔点5ulMarker3和DS2000作为分子量标准。,3.,电泳,打开电源开关，调节电压至3-5v/cm即100V，可见溴酚蓝条带由负极向正极移动，约一小时可观察,24,4 观察,用凝胶成像系统观察电泳好的凝胶，打开紫外灯，可以看到橙红色核酸条带，根据条带的粗细和荧光强度，可粗略估计样品DNA的浓度。同时根据已知的分子量的标准DNA-，通过线性DNA条带的想对位置初步估计样品分子量,25,五、实验注意事项,1 用微波煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的1/3，否则易溢出,2 煮好的胶应冷却至50左右时再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机会,3 如果用紫外投射检测仪观察，要戴上防护观察罩，并最好穿长袖,4 跑好的凝胶放到成像系统内观察时最好少一些的水分，放置时先放好一边，缓缓放下，不要出现气泡,5,核酸吸收260nm紫外线 ，导致DNA的断裂，因此回收DNA应在长波紫外线下观察较好，以减少对DNA的损伤 。并且荧光易淬灭，注意观察的时期，不要反复在紫外下照射。,26,六、实验结果分析,Marker 3,DS2000,上图为凝胶的观察结果，最左边的两条泳带为Marker 3和DS2000做为分子量标准。从右边数倒数第三条带为我的样品的条带，所得条带比较亮，可见所提质粒浓度比较高 。,MINE,27,七、思考题,1 DNA分子在碱性中带什么电荷？电泳时向哪一极运动？,答：,DNA分子是两性解离分子， pH8.0-8.3时，碱基几乎不解、,离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，所以DNA分子在,碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。,2 Loadingbuffer的成分是什么？各有什么作用？,答： Loadingbuffer由蔗糖（或甘油）和溴酚蓝（或二甲苯FF）,组成。,蔗糖,（或甘油）,的作用是增加样品密度，使其比重增加，,以确保DNA均匀沉入加样孔内，不漂浮在缓冲液中。,溴酚蓝,（或二甲苯FF）,起指示剂的作用，在电泳中形成肉眼可见的指,示带，可预测核酸电泳的速度和位置；并且使样品呈色，使加样操作更方便,28,3 质粒DNA有哪些构型？其迁移率有何差异？,答：质粒有超螺旋、线性和开环三种构型。,其中超螺旋的共价闭合环状结构的质粒DNA（SC）的泳动速度最快，一条链断裂的开环状质粒DNA（OC）泳动速度最慢，二条链断裂的线性DNA（L）居中，通过凝胶电泳和EB染色的方法可将不同构型的DNA分别开来。,29,4 DNA荧光染料的发光原理,答 ：,以溴化乙锭为例，溴化乙锭含有一个可以嵌入,DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团。它与DNA,的结合几乎没有碱基序列特异性。在高离子强度的饱,和溶液中，大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。,当染料分子插入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并,通过范德华力与上下碱基相互作用。这个基团的固定,位置及其与碱基的密切接近，导致与DNA结合的染料,呈现荧光，其荧光产率比游离溶液中染料有所增加。,DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而,被结合的染料本身吸收302nm和366nm的光辐射。,这两种情况下，被吸收的能量在可见光谱红橙区的,590nm处重新发射出来。,30,5 什么是迁移率？影响迁移率的因素有哪些？什么是分辨率？分辨率与凝胶浓度有什么关系？,答：,电泳迁移率（m）是指在单位电场强度（1V/cm）时带电分子的迁移速度。,迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的粘度成反比。,分辨率是指凝胶的有效分离范围。分辨率随着凝胶浓度的增大而减小。,31,实验三、DNA的浓度测定及酶切,32,一、实验目的,学习利用紫外分光光度法测定DNA溶液浓度及斑点实验法定量DNA溶液浓度及利用限制性内切酶切割DNA的方法，并通过电泳检测酶切的效果，为以后的连接作准备。,33,二、实验原理,DNA的吸收光谱在260nm处，据计算，测定此波长下DNA溶液的OD值，当OD,260,=1时，双链DNA 含量约为50ug/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中DNA 含量。由于蛋白质的吸收峰在280nm处，在测定DNA含量时，还常计算OD,260,/OD,280,之值，如改值为1.8-2.0时，认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。,目前已发现三类不同的限制性内切酶即型、型、和型。其中型能专一识别碱基顺序，并在该处切断双链DNA，因而在基因工程中得到广泛应用。DNA经限制性内切酶作用产生两种断裂状态：粘性末端或平端。,34,目前已发现三类不同的限制性内切酶即I型 II,型和 III型。其中II型可以专一识别碱基序,列，并在该处切断DNA,得到广泛应用。DNA,经限制性内切酶作用产生两种断裂状态：粘性,末端和平齐末端。限制性内切酶III识别的碱基序列是：,5-AAFCTT-3,3-TTCGAA-5,酶切作用后产生5突出粘性末端,A 5 -AGCTT,TTCGA-5 A,35,三、实验材料、试剂和仪器,1 实验材料：,提纯后的质粒DNAmp3和psk,2 试剂：限制性内切酶HindIII及对应的缓冲液、无菌双蒸水、10TBE电泳缓冲液、0.8琼脂糖、载样缓冲液,3 仪器,分光光度计、电泳仪、微型电泳槽、紫外投射检测仪、凝胶成像系统、恒温培养箱,微量移液器、微量离心管、吸管头软干、点样板、保鲜膜、一次性手套,36,四、实验步骤,1. DNA浓度纯度的测定,（1）紫外分光光度计法,取实验一的DNA 2L（约100-200ng）至一干净的离心管，加入198LddH,2,O稀释。先加200ul ddH,2,O至比色杯，进行紫外光空白测定，然后倒掉ddH,2,O，加入200L已稀释的DNA溶液，测定260nm以及280nm的光吸收值，并记录DNA浓度及OD260/OD280 比值,37,（2）Goldview斑点实验定量质粒DNA, 取1L GW于1.5ml离心管，加入1mL1TE缓冲液将其稀释1000倍, 用1xTE稀释定量Marker -DNA 330ng/ul稀释为：5ng/ul、10ng/ul、20ng/ul、50ng/ul、100ng/ul, 取一张保鲜膜或塑料手套，在其上点：,对照： 1L Golden view + 1L稀释1xTE,Marker -DNA,:,1L Golden view + 1L稀释,的,-DNA,样品： 1L Golden view + 1L 质粒, 放入凝胶成像系统内观察拍照并进行分析,38,2 酶切,小量酶切 与 MP3的大量酶切,在1.5mL试管（最好放冰中预冷管）中加入下面的酶切体系，轻弹混匀, 37恒温5-6h （快的情况下可以2h）,ddH2O ：9.5L,10xloadingbuffer :2L,plasmidDNA ：8L,酶（HindIII):0.5L,ddH2O ：63ul,10 x buffer ：8ul,DNA（240 .6ng/ul) 需2ng：8ul,Hind ： 1ul,MP3的大量酶切（80L酶切体系,小量酶切（ 20L酶切体系 ）,39, 酶切完成后，放于4或（-20 ）使反应停止 ：电泳前应在4保存, 电泳检测,酶切后样品：20 L+2 L 10xloading buffer,酶切前的样品：1 ul DNA+1ul loading buffer+8ul ddH2O, 把电泳凝胶放入凝胶成像系统观察，然后拍照分析,40,五、实验注意事项,41,六、思考题,42,七、实验结果分析,43,