第八章 分子杂交技术

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第八章,分子杂交技术,第一节 分子杂交的原理,核酸分子杂交,（,nucleic acid hybridization,）,指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。,分子杂交是通过配对碱基对之间的,非共价键,（主要是氢键）结合，从而形成稳定的双链区。杂交分子的形成并不要求两条单链的碱基顺序完全互补，所以不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序（即某种程度的同源性）就可以形成杂交双链,不同来源的,DNA,或,RNA,单链在一定条件下重新组成的新的双链分子,杂交分子,若所用的核酸探针的片段较长,(,几百个核苷酸以上,),，可以得到很准确的鉴定结果。但若人工合成的寡核苷酸探针片段较短（如,20,30,个核苷酸），则难免会出现准确性差的假阳性现象。,杂交的双方是待测核酸和已知核酸序列，已知核酸序列称探针。,杂交的双方：探针和要检测的核酸。,将核酸分子固定在固相支持物上，然后用标记的探针和被固定的分子杂交，经显影后显示出目的,DNA,或,RNA,分子所处的位置。,被检测的核酸：,克隆化的基因组,DNA,提纯的,细胞总,DNA,细胞内杂交（细胞原位杂交）,细胞总,RNA,变性,复性,DNA-DNA,杂交双链分子,杂交过程是高度特异性的,可以根据所使用的探针已知序列进行特异性的靶序列检测。,一、,DNA,变性与复性,（一）,DNA,变性,1,、定义：某些理化因素导致两条,DNA,链间的氢链断裂变为单链的过程，称,DNA,变性,2,、变性的方法：,（,1,）热变性：温度升高到,90100,时，双链核酸 分子链间的氢键完全断裂。,（,2,）酸碱变性：,pH,值低于,3,或高于,10,时，双链核酸分子链 间的氢键断裂。,（,3,）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使 双链核酸分子链间的氢键断裂。,GC,含量与,Tm,值之间的关系,（,G+C,）,%=,（,Tm-69.3) 2.44,Tm =(G+C)%0.41+69.3,（二）复性,1,、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。,具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：,DNA/DNA,、,RNA/DNA,、,RNA/RNA,、寡核苷酸,/DNA,和寡核苷酸,/RNA,。,2,、复性过程,（,1,）单链分子间碰撞形成局部双链,（,2,）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离,（,3,）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列,（,4,）形成完整的双链分子,二,.,分子杂交的一般程序,待测核酸制备,滤膜上核酸固化,杂 交,去除未参与杂交的探针,检 测 杂 交 信 号,制备探针核酸片段,探 针 标 记,加入标记核酸探针,电泳,制备,DNA,或,RNA,样品,与固定基质结合,80,真空固定,预杂交,加入标记探针杂交,洗涤,放射自显影或显色反应。,三、,核酸探针的制备,探针（,Probe),的概念,:,一段带有检测标记的与目的基因或目的,DNA,特异互补的已知核苷酸序列。,1.,探针,的制备方法,长度一般以,50300bp,为宜，有时达,1.5kb,。制备方法：,(1) DNA,重组技术,(2) PCR,扩增,(3),化学合成,2.,探针的分类,据来源及性质不同可分为：,(1),基因组,DNA,探针,(2) cDNA,探针,(3) RNA,探针,(4),寡核苷酸探针,合成,寡核苷酸探针注意原则,(1),长度（,10-50 bp);,(2) G:C,对含量,40%-60%,；,(3),探针内避免互补；,(4),避免同一碱基连续出现；,(5),与非靶序列有,70%,以上同源性或连续,8,个以上碱基序列相同，最好不用。,3,.,核酸探针的标记,为确定,探针是否与相应基因组,DNA,杂交,，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号。,标记的种类,同位素：,32,P,、,35,S,、,3,H,、,125,I,等标记探针,非同位素：,生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物,第二节 核酸分子杂交的方法,按其分子种类划分,（,1,）,Southern,印迹杂交,（,2,）,Northern,印迹杂交,3,）,Western,印迹杂交,按待测核酸是否固定在固相支持物上分：,固,-,液相杂交,膜上印迹杂交,原位杂交,液相杂交,RNA,酶保护分析法,核酸酶,S1,保护分析法,一、,Southern,杂交,其基本原理是将待检测的,DNA,样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相,DNA,的位置上显示出杂交信号。通过,Southern,杂交可以判断被检测的,DNA,样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。,DNA,经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交。被检对象为,DNA,，探针为,DNA,或,RNA,。,利用这一技术可进行克隆基因,DNA,的酶切图谱分析，基因组中某一基因的定性与定量分析、基因点突变及限制性片段长度多态性分性等。,步骤：,酶切,DNA,凝胶电泳分离各酶切片段,然后使,DNA,原位变性。,(2),将,DNA,片段转移到固体支持物,(,硝酸纤维素滤膜或尼龙膜,),上。,(3),预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点。,(4),让探针与同源,DNA,片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针。,(5),通过显影检查目的,DNA,所在的位置。,带有,DNA,片段的凝胶,DNA,分子,限制片段,限制性酶切割,琼脂糖电泳,至,膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）,上,转膜,杂交、显影,凝胶,滤膜,用缓冲液转移,DNA,吸附有,DNA,片段的膜,Southern,印迹杂交的技术流程,（一）待测核酸样品的制备,1,、裂解或破碎细胞,2,、抽取纯化基因组,DNA,3,、限制酶消化,DNA,为大小不同的,DNA,片段,（二）待测,DNA,样品的电泳分离,所用分子量标准可用核素标记，,杂交后的标准分子量,DNA,也能显影出条带。,（三）凝胶中核酸的变性（碱变性）,分子量超过,10kb,的较大的,DNA,片段，需要很长的转移时间。必须将最长的,DNA,片段控制在大约,2kb,以下。,如果靶序列,5kb,，则需进行脱嘌呤处理（,DNA,产生缺口将提高转移的质量）。,把凝胶浸在,0.25mol/LHCl,中，室温轻轻晃动，直到溴酚蓝从蓝变黄。,注意：处理人类基因组,DNA10,分钟；处理植物基因组,DNA20,分钟。,再,把凝胶浸在灭菌双蒸水中,如果靶序列,5kb,，则直接进行下面的步骤,(1),把凝胶浸在变性液（,0.5mol/LNaOH,，,1.5mol/LNaCl,）中，室温,215,分钟，轻轻晃动。,(2),把凝胶浸在灭菌双蒸水中,(3),把凝胶浸在中和液中（,0.5mol/L Tris-HCl,，,Ph7.5,，,1.5mol/L NaCl,），室温,215,分钟。,(4),在,20SSC,中平衡凝胶至少,10,分钟。,（四）,Southern,印迹,高盐下通过毛吸作用将,DNA,从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜（尼龙膜也较长用）上，烘干固定后即可用于杂交,本方法由,Southern,发明,故又称为,Southern,转移,(,或印迹,),（,1,）毛细管虹吸印迹法,利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的,DNA,转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的,NaCl,和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的,DNA,片段垂直向上运动，凝胶中的,DNA,片段移出凝胶而滞留在膜上,白瓷盘,玻璃板,滤纸,凝胶,尼龙膜,滤纸,吸水纸,玻璃板,重物,吸水纸转膜,优点是简单,不需要用其他仪器。缺点是转移时间较长,转移后杂交信号较弱,（,2,）真空转移法,此法原理与毛细管虹吸法相同，只是以滤膜在下，凝胶在上的方式将其放置在一个真空室上，利用真空作用将转膜缓冲液从上层容器中通过凝胶和滤膜抽到下层真空室中，同时带动核酸片段转移到凝胶下面的尼龙膜或硝酸纤维素膜上。,优点是快速,在,30,分钟内就能从正常厚度,(4-5mm),和正常琼脂糖浓度,(109 cpm/g),互补,DNA,。如果将,10g,基因组,DNA,转移到滤膜上，并与长度为几百个核苷酸的探针杂交,曝光过夜,则可检测出哺乳动物基因组中,1kb,大小的单拷贝序列。,（七）,Southern,杂交在医学中的应用,1,、酶切图谱分析,2,、特定基因定性和定量,3,、基因突变分析,4,、限制性片段长度多态性的分析,二、,Northern,印迹杂交,原理：,Northern,杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的,RNA,分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的,DNA,或,RNA,探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标,RNA,所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标,RNA,在所测样品中的相对含量（即目标,RNA,的丰度）。,1,、鉴别,RNA,2,、探针可用,DNA,或,RNA,片段,3,、待测样品为总,RNA,或,mRNA,Northern,印迹与,Southern,印迹的不同点,1.,总,RNA,不需要进行酶切，即是以各个,RNA,分子的形式存在，可直接应用于电泳；,2,、变性：,RNA,电泳前加热变性，,电泳在变性条件下进行,以去除,RNA,中的二级结构,保证,RNA,完全按分子大小分离。变性电泳主要有,3,种,:,乙二醛变性电泳、甲醛变性电泳和羟甲基汞变性电泳。,DNA,电泳前和电泳 中不变性,3,、转膜：,RNA,转膜前不需变性和中和处理,Southern,印迹时，,DNA,转膜前需进行碱变性及中和处理。,在烘烤前,RNA,与膜结合得并不牢固，所以在转印后不能用低盐缓冲液洗膜，否则,RNA,会被洗脱。,4,、靶核酸为,RNA,5.,Northern,也可检测目标,mRNA,分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何,步骤,1.,总,RNA,提取,2.,变性胶的制备：,5,甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛等制备琼脂糖凝胶,3.,样品变性：取总,RNA,加入,5,甲醛凝胶电泳缓冲液,l,、,37%,甲醛、甲酰胺，变性,4.,电泳,5.,将,RNA,从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：,6.,膜置,80,，真空干烤,1-2hr,。烤干后的膜用塑料袋密封，,4,保存备用。,7.,预杂交,8.,杂交：将变性的探针（,95-100,变性,5min,，冰浴,5min,）加入到预杂交液中，,42,杂交,16hr,。,9.,洗膜：,(1),倾去杂交液。,(2)2SSC/0.1%SDS,室温洗,15min,。,(3)0.2SSC/0.1%SDS,，,55,洗,15min2,次。,10.,压片放射显影。,