第五章+酶分子修饰

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Chapter 5,Directed Evolution and,Modification of Enzyme Molecule,酶的分子修饰和定向进化,Contents of chapter 5,1,、,酶的结构,2,、酶分子修饰及其基本要求和条件,3,、酶分子的修饰方法,4,、酶修饰后的性质变化,Go,Go,Go,Go,5,、酶的定向进化,Go,酶分子修饰,酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此，日益增多的酶制剂已用于食品发酵、疾病诊治和预防、环境保护和监测、化工产品的生产等领域。,为什么要对酶进行修饰,?,酶在实际应用中有,局限性,：,1,、作为异体蛋白在体内,难于吸收,、易引起,免疫反应和被识别降解,；,2,、酶蛋白经不起温度、酸碱、有机溶剂及时间的考验，,半衰期短、易变性失活,；,3,、酶的活性、作用专一性和最适条件,不一定能适应生产工艺要求,，,限制了酶制剂的应用范围。,酶的结构,酶分子,非必需基团,必需基团,活性中心,必需基团,活性中心外,必需基团,结合基团,催化基团,非活性中心,活性中心,酶的结构,酶活性中心（,activity site),酶分子中直接与底物结合，并催化底物发生化学反应的部位，称为酶的活性中心。它是由三级结构中空间位置相邻的几个氨基酸共同构成的。,酶的结构,酶活性中心（,activity site),酶的活性中心包括两个功能部位：一个是结合部位，是酶与底物结合的基团，决定酶的专一性；另一个是催化部位，催化底物敏感键发生化学变化的基团，决定酶的催化能力。但这两个部位并不是各自独立存在的，相互联系。,酶的结构,酶的结构,活性中心的重要化学基团,7,种氨基酸出现的频率最高,Lys,Asp,Glu,Cys,His,Tyr,Ser,某些功能基团,如（氨基、羧基、巯基、羟基和咪唑基）是酶的必需基团。,维持活性中心应有空间构象所必需的基团,影响底物中某些化学键的稳定，催化底物发生化学反应并将其转化成产物,与底物相结合，使底物与酶的一定构象形成复合物,酶的结构,活性中心的共性,:,1,、活性部位只占酶分子很小的一部分（,1-2%,）。,活性中心,酶的结构,活性中心的共性,:,2,、活性部位是一个三维实体。,3,、活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中。,酶的结构,活性中心的共性,:,4,、活性中心构象不是固定不变的（诱导契合）。,酶的结构,活性中心的共性,:,5,、酶与底物通过盐键、氢键、范德华力和疏水作用等次级键结合。,酶的结构,Problem?,既然活性中心如此重要，我们应该如何检测它呢？,活性中心研究方法,物理研究法,化学修饰法,蛋白质工程,酶的结构,研究酶活性中心的方法,1.,物理学方法：,用,X,射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物（包括酶和底物）的相对位置。,酶的结构,研究酶活性中心的方法,1.,物理学方法：,X,射线衍射原理：,X,射线是一种波长很短的电磁波，能穿透一定厚度的物质，当一束,X,射线通过晶体时将发生衍射，衍射波叠加的结果使射线的强度在某些方向上加强，在其他方向上减弱。分析在照相底片上得到的衍射花样，便可确定晶体结构。,酶的结构,酶的结构,研究酶活性中心的方法,2,、化学修饰法,1),非专一性化学修饰,用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团相互作用。,Problem?,怎样判断,化学试剂是同活性中心内的必需基团结合？,How to determine ?,酶的结构,研究酶活性中心的方法,2,、化学修饰法,1),非专一性化学修饰,某基团被修饰后,无非出现以下两种情况：,酶活性不变,该基团可能不是酶的必需基团。,酶活性降低或丧失,该基团可能是酶的必需基团。,酶的结构,研究酶活性中心的方法,2,、化学修饰法,1),非专一性化学修饰,活性中心基团的鉴定标准,失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系。,S,或可逆抑制剂有保护作用（活性中心）。,先加,S,加共价修饰剂 透析除去,S,活性不丧失,酶的结构,研究酶活性中心的方法,2,、化学修饰法,2),专一性化学修饰,（,1,）,基团专一性修饰,用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团。,酶的结构,研究酶活性中心的方法,2,、化学修饰法,2),专一性化学修饰,（,2,）,位点专一性修饰（亲和标记）,采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物。,作用机制：利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记。,酶的结构,研究酶活性中心的方法,2,、化学修饰法,2),专一性化学修饰,（,2,）,位点专一性修饰（亲和标记）,含有活泼反应基团的底物类似物：,与,S,结构相似,，与活性中心的氨基酸残基亲和力大，而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小。,具有活泼的化学基团,（如卤素）可与活性中心的基团形成稳定的共价键。,酶的结构,3.,蛋白质工程：,将酶相应的,DNA,定点突变，突变的,DNA,只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白，测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需。,改变酶特性有两种主要的方法,1),通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性。,2),通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的。,1,什么是酶分子修饰？,通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。,即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。,酶分子修饰的原理,1,、,修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。,从而增强酶天然构象的稳定性与耐热性。,酶分子修饰的原理,2,、,大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。,从而保护酶活性部位并起到低抗抑制剂和抗蛋白水解酶的作用。,酶分子修饰的原理,3,、,酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。,4,、,酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇,抗原性降低乃至消除，“遮盖”了抗原决定簇,阻碍抗原、抗体结合。,消除酶的抗原性，使酶稳定。,酶分子修饰的原理,5,、,大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。,修饰剂的选择原则,1.,修饰剂的分子量及链的长度（要求有较大的分子量）。,2.,修饰剂上反应基团的数目及位置（要求有较多的反应活性基团）。,3.,修饰剂上反应基团的活化方法与条件（要求有完善的方法）。,酶分子修饰的基本要求和条件,对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。,（,1,）,酶的稳定性,热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、,pH,、抑制剂等。,（,2,）,酶活性中心的状况,活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。,酶分子修饰的条件,修饰反应尽可能在,酶稳定条件,下进行，并尽量,不破坏酶活性功能的必需基团,，使,修饰率高,，同时酶的,活力回收高,。,（,1,）,pH,与离子强度,pH,决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。,（,2,）,修饰反应的温度与时间,严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。,（,3,）,反应体系中酶与修饰剂的比例,回本章目录,酶分子的修饰方法,修饰方法,表面化学,修饰,酶分子内部,修饰,大分子修饰,小分子修饰,交联修饰,固定化修饰,蛋白主链,修饰,氨基酸置换,修饰,金属离子,置换修饰,酶分子的修饰方法,一、酶的表面化学修饰,（一）大分子修饰（大分子结合修饰）,是目前应用最广的酶分子修饰方法。,1.,定义：,利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生某些精细的改变，从而改变酶的特性与功能的方法。,酶分子的修饰方法,（一）大分子修饰,1,、非共价修饰,使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，它们既能通过,氢键,固定在酶分子表面，也能通过,氢键,有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。,一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。,另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。,酶分子的修饰方法,（一）大分子修饰,2,、共价修饰,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过,共价键,连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。,例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以,降低或消除酶的抗原性,，而且提高了,抗蛋白酶的能力,，延长了酶在体内的,半衰期,从而提高了酶药效。,大分子修饰,(,共价,),的过程,修饰剂的活化,：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。,修饰,：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、,pH,值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。,分离,：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,酶分子的修饰方法,（一）大分子修饰,3.,应用：,如：,PEG,超氧化物歧化酶（,SOD,）,PEG,溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）,PEG,天门冬酰胺酶（,ASNase,）,消除了抗原性、延长了酶在体内的半衰期,又如：用葡聚糖修饰,-,淀粉酶，淀粉酶，胰蛋白酶、过氧化氢酶，,提高了酶的热稳定性。,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,（酶蛋白侧链基团修饰）,1,、定义,通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应。,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,侧链基团：,组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。主要有：氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。,1,、侧链基团修饰剂：,采用的各种小分子化合物。,20,种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰，它们一般具有亲核性。,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,根据氨基酸侧链,R,基的极性，,20,种氨基酸可分成,4,类,。,（,1,）、非极性,R,基氨基酸（共,8,种）：,丙氨酸,(Ala),亮氨酸,(,Leu,),缬氨酸,(Val),异亮氨酸,(Ile),苯丙氨酸,(,Phe,),色氨酸,(,Trp,),甲硫氨酸,(Met),脯氨酸,(Pro),酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,根据氨基酸侧链,R,基的极性，,20,种氨基酸可分成,4,类,。,（,2,）、无电荷的极性,R,基氨基酸（共,7,种）：,丝氨酸,(Ser),苏氨酸,(,Thr,),酪氨酸,(Tyr),半胱氨酸,(,Cys,),天冬酰胺,(,Asn,),甘氨酸,(,Gly,),谷氨酰胺,(,Gln,),酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,根据氨基酸侧链,R,基的极性，,20,种氨基酸可分成,4,类,。,（,3,）、带正电荷的极性,R,基氨基酸（共,3,种）：,赖氨酸,(Lys),精氨酸,(,Arg,),组氨酸,(His),酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,根据氨基酸侧链,R,基的极性，,20,种氨基酸可分成,4,类,。,（,4,）、带负电荷的极性,R,基氨基酸（共,2,种）：,天冬氨酸,(Asp),谷氨酸,(,Glu,),酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,修饰反应,烷基化反应,酰化反应,氧化还原,反应,芳香环取代,反应,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,1),烷基化反应,试剂特点：,烷基上带活泼卤素，导致酶分子的亲核基团（如,NH,2,，,-SH,等）发生烷基化。,可作用基团：,氨基（,Lys,，,Arg,），巯基（,Cys,），羧基（,Asp,、,Glu,），甲硫基（,Met,），咪唑基（,His,）。,修饰剂：,2,，,4,二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺等。,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,1),烷基化反应,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,2),酰基化反应,试剂特点：,含有 结构，作用于侧链基团上的亲核基团，使之酰基化。,可作用基团：,氨基，巯基，醇羟基（,Ser,、,Thr,），酚羟基（,Tyr,）,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,2),酰基化反应,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,3),氧化和还原反应,试剂特点：,具有氧化性或还原性。,氧化剂：,H,2,O,2,，,N-,溴代琥珀酰亚胺,可被氧化的侧链基团：巯基，甲硫基，吲哚基（,Trp,）、咪唑基，酚基等。,还原剂：,2,巯基乙醇、,DTT,等。,可被还原的侧链基团：二硫键。,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、侧链基团修饰,3),氧化和还原反应,连四硫酸盐氧化巯基，,DTT,还原逆回，用于保护巯基。,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,1),氨基的化学修饰：,来源：,Lys,Arg, His,Gln,修饰反应：酰基化与烷基化,酰基化修饰剂,:,三硝基苯磺酸（,TNBS,）、丹磺酰氯（,DNS,）,烷基化修饰剂：,2,，,4,二硝基氟苯（,DNFB,）、碘乙酸、碘乙酰胺、亚硝酸等,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,2),羧基的化学修饰,修饰羧基的反应专一性较差。,常用,水溶性碳化二亚胺,修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,1,、侧链基团修饰,4),芳香环取代,反应,试剂：卤（碘）化，硝化试剂。,碘代,硝化,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,3),胍基,的化学修饰,来源：,Arg,修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。,修饰剂： 丁二酮,二羰基化合物,1,，,2,环己二酮,苯乙二醛,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,4),巯基,的化学修饰,来源：,Cys,修饰反应,:,烷基化,修饰剂：碘乙酸,(IAA),、碘乙酰胺,(IAM,）、,N-,乙基马来酰亚胺（,NEM,）（常用的专一修饰巯基试剂,),E-SH + R-X, E-SR +HX,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,5),二硫键的化学修饰,还原：,巯基乙醇、二硫苏糖醇（,DTT,）,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,6),咪唑基的化学修饰,来源：,His,修饰反应,:,酰基化与烷基化,酰基化修饰剂,:,常用焦碳酸二乙酯,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,6),咪唑基的化学修饰,烷基化修饰剂：碘乙酸,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,7),酚羟基的化学修饰,来源：,Tyr,修饰反应：芳香环取代反应,修饰剂：碘、硝化试剂（四硝基甲烷）,酶分子的修饰方法,（二）小分子修饰,2,、,特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰,8),吲哚基的化学修饰,来源：,Trp,修饰反应：氧化反应,修饰剂：,N-,溴代琥珀酰亚胺,酶分子的修饰方法,一、酶的表面化学修饰,交联修饰（交联法）,用双功能基团试剂,(,如戊二醛,),，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。,固定化修饰（共价偶联法）,通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适,pH,、最适温度和稳定性发生改变。,酶分子的修饰方法,二、酶分子内部修饰,（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）,蛋白主链修饰采用酶法（用专一性较强的蛋白酶或肽酶作为修饰剂）。,(,一,),酶蛋白主链修饰,(,肽链有限水解修饰,),利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。,酶蛋白主链修饰主要是靠酶切,/,酶原激活法。,a,、胃蛋白酶原的激活,酶分子的修饰方法,二、酶分子内部修饰,（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）,酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中的一种：,1,引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。,2,仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。,3,有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位，酶活力提高。,后两种情况，肽链的水解在限定的肽键上进行，称肽链有限水解。,酶分子的修饰方法,二、酶分子内部修饰,（二）金属离子置换修饰,改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。,（二）酶的金属离子置换修饰,把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。,-,淀粉酶中的钙离子（,Ca,2+,），谷氨酸脱氢酶中的锌离子,(Zn,2+,),，过氧化氢酶分子中的铁离子,(Fe,2+,),，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（,Zn,2+,）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子,(Cu,2+,Zn,2+,),（二）酶的金属离子置换修饰,若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。,金属离子置换修饰的过程,a.,酶的分离纯化,：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。,b.,除去原有的金属离子,：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（,EDTA,）等，使酶分子中的金属离子与,EDTA,等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将,EDTA-,金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。,c.,加入置换离子,：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。,金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。,用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。,氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法,，例如，,Bender,等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。,现在常用的氨基酸置换修饰的方法是,定点突变技术,。定点突变（,site directed mutagenesis,）是,20,世纪,80,年代发展起来的一种基因操作技术。是指在,DNA,序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（,Protein Engineering,）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。,(,三,),氨基酸置换修饰,酶分子的定点突变,1,、基因序列分析,2,、蛋白质结构分析,3,、酶活性中心分析,4,、引物设计进行基因定点突变,5,、酶基因克隆表达,6,、变异特性分析,酶修饰后的性质变化,热稳定性,：一般来说，热稳定性有较大的提高。,抗原性,：比较公认的是,PEG,和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。,各类失活因子的抵抗力,：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。,半衰期,：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。,最适,pH,：大部分酶经化学修饰后，酶的最适,pH,发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适,pH,更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。,Km,的变化,：大多数酶经修饰后，,Vm,没有明显变化，但有些酶经修饰后，,Km,值变大。,回本章目录,二、酶的定向进化,定向进化概念的提出,1993,年,美国科学家,Arnold F H,首先提出酶分子的定向进化的概念，并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶。,二、酶的定向进化,概念,人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行,随机突变,，从一个或多个已经存在的亲本酶（天然的或者人为获得的）出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的,筛选或选择,方法最终获得预先期望的,具有某些特性的进化酶,。,定向进化随机突变选择,定向进化的原理,在待进化酶基因,的,PCR,扩增反应中，利用,Taq,DNA,聚合酶不具有,3,-5,校对功能的性质，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶,(,或蛋白质,),，从而排除其他突变体。,定向进化的基本规则是,“,获取你所筛选的突变体,”,。,定向进化,=,随机突变,+,选择,。前者是人为引发的，后者虽相当于环境，但只作用于突变后的分子群，起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为控制下进行的,二、酶的定向进化,酶分子的,合理设计,(rational design),酶分子的,定向进化,(directed evolution),酶的合理设计,体外定向进化的意义,理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。,所谓酶的体外定向进化，又称实验分子进化，属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制,(,随机突变、重组和自然选择,),，在体外改造酶基因，并定向选择出所需性质的突变酶。,酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围，特别是能够解决合理设计所不能解决的问题，为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径，并且正在工业、农业和医药等领域逐渐显示其生命力。,二、酶的定向进化,随机突变的策略,易错,PCR,技术,(error-prone PCR),DNA,改组,(DNA,shuflling,),：由美国,Stemmer,于,1994,年首次提出 一项体外重组技术,随机引发重组,(RPR) , 1998,年,Arnold,提出了一种有效的新方法,交错延伸技术,(,StEP,),：由,Zhao,等 提出,是一种简化的,DNA shuffling,技术,二、酶的定向进化,易错,PCR,易错,PCR,（,error prone PCR,）是指在扩增目的基因的同时引入,碱基错配,，导致目的基因随机突变。,连续易错,PCR (sequential error prone PCR),策略。即将一次,PCR,扩增得到的有用突变基因作为下一次,PCR,扩增的模板，连续反复地进行随机诱变。,DNA,改组和外显子改组,DNA,改组,（,DNA shuffling,）,又称有性,PCR(sexual PCR),，,原理。 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会，导致更大的变异，最终获取最佳突变组合的酶。通过,DNA,改组,不仅可加速积累有益突变，而且可使酶的,2,个或更多的已优化性质合为一体。,外显子改组（,exon,shuffling,）,类似于,DNA,改组，两者都是在各自含突变的片段间进行交换，前者尤其适用于真核生物。在自然界中，不同分子的内含子间发生同源重组，导致不同外显子的结合，是产生新蛋白质的有效途径之一。与,DNA,改组不同，外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动，而,DNA,改组不受任何限制，发生在整个基因片段上。,DNA,改组原理,二、酶的定向进化,体外随机引发重组,体外随机引发重组,(random priming in vitro recombination, RPR),以,单链,DNA,为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短,DNA,片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短,DNA,片段中也会有少量的点突变，在随后的,PCR,反应中，它们,互为引物,进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。,二、酶的定向进化,交错延伸,交错延伸,(stagger extension process,StEP,),在,PCR,反应中把常规的,退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。,定向进化的选择策略,1,、定向进化中，突变具有随机性，但通过,选择特定方向的突变限定了进化趋势,，加之控制实验条件，限定突变种类， 降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。,2,、通常,筛选方法必须灵敏,至少与目的性质相关,。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。,高通量的筛选体系,二、酶的定向进化,定向进化的筛选策略,突变体分离,琼脂板涂布法：在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌的生长情况、培养基颜色、特定反应的出现等判断是否具有目的基因。,微孔板悬浮法：在含生色底物平板上培养，挑取具有活性的克隆接种到,96,孔板上检测吸光度。,微球细胞固定法：与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。,流式细胞计数法：细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐个通过流式细胞计数仪进行测定。,二、酶的定向进化,定向进化的筛选策略,酶检测,通过酶促反应的特征,加入底物显色,荧光共振能量转移,同位素标记底物,通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测,二、酶的定向进化,定向进化的筛选策略,信号探测,分光光度计和荧光酶标仪,气相色谱和高效液相色谱,质谱和核磁,二、酶的定向进化,定向进化与自然进化的异同点,定向进化的实质是达尔文进化论在分子水平上的延伸和应用。,定向进化是在体外模拟突变、重组和选择的自然进化，使进化朝着人们需要的方向发展。,两者的不同：,进化动力不同： 保守突变 非保守取代；,进化速度不同： 非常漫长 只需几年、甚至几天；,进化目标不同： 适应环境 超越生物学意义的要求，探索所希望的蛋白质在顺序空间的可及性。,二、酶的定向进化,定向进化技术,酶的体外定向进化应用实例,回本章目录,目标酶,所需功能,方法,结果,实施菌种,卡那霉素核苷基转移酶,热稳定性,定位诱变,+,选择,在,60-50,酶半衰期增加,200,倍,耐热脂肪芽孢杆菌,枯草杆菌蛋白酶,作用于有机溶剂,易错,PCR+,选择,在,60,二甲基亚砜主仆女冠活力增强,170,倍,枯草杆菌,-,内酰胺酶,作用于新底物,DNA,改组,+,选择,对,cefotaxime,的抗性增加,32000,倍,大肠杆菌,对硝基苯酯酶,有机溶剂中的底物特异性和活性,易错,PCR+,重组,活力增加,60-150,倍,大肠杆菌,胸苷激酶,第五特异性 基因理疗,交错延伸,+,选择,活力增加,43,倍,大肠杆菌,-,半乳糖苷酶,底物特异性,DNA,改组,+,选择,活力增加,66,倍底物特异性增加,1000,倍,大肠杆菌,砷酸脱毒途径,砷酸抗性,DNA,改组,+,选择,抗性增加,12,倍,大肠杆菌,