第二章 提取分离和鉴定的方法2

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 提取分离和鉴定方法,第二章 提取分离和鉴定方法,第一节 天然药物有效成分的,提取,第二节 天然药物有效成分的,分离与纯化,第三节 结构研究方法（,四大光谱,）,第一节 天然药物有效成分的提取,（常用的溶剂的性质）,环己烷，石油醚，苯，氯仿，乙醚，乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，乙醇，甲醇,极性：小 大,亲脂性：大 小,亲水性：小 大,1,、比水重的有机溶剂：氯仿,2,、与水分层的有机溶剂：环己烷,正丁醇,3,、能与水分层的极性最大的有机溶剂：正丁醇,4,、与水可以以任意比例混溶的有机溶剂：丙酮,甲醇,5,、极性最大的有机溶剂：甲醇,6,、极性最小的有机溶剂：环己烷,7,、常用来从水中萃取苷类、水溶性生物碱类成分的有机溶剂：正丁醇,8,、溶解范围最广的有机溶剂：乙醇,第一节 天然药物有效成分的提取（常见的提取方法）,1,、溶剂提取法,（浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法等,）,2,、水蒸气蒸馏法,3,、升华法。,1,、溶剂提取法,（,1,）溶剂提取法的原理：,相似相溶,原理,（,2,）各种溶剂提取法,溶剂提取法一般包括浸渍法、渗漉法、煎煮法、回流提取法、连续回流提取法等，其使用范围及特点见下表。,第一节 天然药物有效成分的提取（常见的提取方法）,提取方法,溶剂,操作,提取效率,使用范围,备注,浸渍法,水或有机溶剂,不加热,效率低,各类成分，尤遇热不稳定成分,出膏率低，易发霉，需加防腐剂,渗漉法,有机溶剂,不加热,脂溶性成分,消耗溶剂量大，费时长,煎煮法,水,直火加热,水溶性成分,易挥发、热不稳定不宜用,回流提取法,有机溶剂,水浴加热,脂溶性成分,热不稳定不宜用，溶剂量大,连续回流提取法,有机溶剂,水浴加热,节省溶剂、效率最高,亲脂性较强成分,用索氏提取器，时间长,1,、溶剂提取法,第一节 天然药物有效成分的提取（常见的提取方法）,2,、水蒸气蒸馏法,适用于具有,挥发性,、能随水蒸汽蒸馏而,不被破坏,、难溶或,不溶于水,的成分的提取，如挥发油、小分子的香豆素类、小分子的醌类成分。,3,、升华法：,固体物质受热不经过熔融，直接变成蒸汽，遇冷后又凝固为固体化合物，称为,升华,。中草药中有一些成分具有升华的性质，可以利用升华法直接自中草药中提取出来。如樟脑、咖啡因。,第一节 天然药物有效成分的提取（常见的提取方法）,第二节 天然药物有效成分的分离与纯化,1,、根据物质溶解度差别进行分离 ；,2,、根据物质在两相溶剂中的分配比不同进行分离 ；,3,、根据物质的吸附性差别进行分离 ；,4,、根据物质分子大小进行分离 ；,5,、根据物质解离程度不同进行分离 ；,6,、根据物质的沸点进行分离 。,2.1,物质溶解度差别,1,、结晶及重结晶法,2,、溶剂分离法,利用不同温度可引起物质溶解度的改变的性质以分离物质。,结晶,:,将不是结晶状态的固体物质处理成结晶状态的操作；,重结晶,:,将不纯的结晶进一步精制成较纯的结晶的过程。,1,、结晶及重结晶法,2,、溶剂分离法,（,1,）溶剂选择的一般原则：,不反应；,冷时对所需要的成分溶解度较小，而热时溶解度较大；,对杂质溶解度很大或很小；,沸点低，易挥发；,无毒或毒性小。,若无理想的单一溶剂时，可以考虑使用混合溶剂。,一般常用甲醇、丙酮、氯仿、乙醇、乙酸乙酯等。,2.1,物质溶解度差别,（,2,）结晶操作：,结晶操作实际是进一步分离纯化过程，一般是应用适量的溶剂在,加热,至沸点的情况下将化合物,溶解,，制成过饱和溶液，趁热过滤去除不溶性杂质，放置冷处，以析晶。,1,、结晶及重结晶法,2,、溶剂分离法,2.1,物质溶解度差别,（,3,）结晶纯度的判定：,结晶形态和色泽,：,单一化合物的结晶具有结晶形状均一和均匀的色泽。,熔点和熔距：,单一化合物具有一定的熔点和较小的熔距，结晶前后的熔点应一致，熔距很窄，在,1,2,的范围内。但要注意双熔点，如汉防己乙素、芫花素及一些与糖结合的苷类化合物。,色谱法：,单一化合物在薄层色谱或纸色谱层析中经三种不同的溶剂系统展开，均为一个斑点者。,1,、结晶及重结晶法,2,、溶剂分离法,2.1,物质溶解度差别,1,、结晶及重结晶法,2,、溶剂分离法,（,1,）在中草药提取液中加入另一种溶剂以改变混合物溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。,如：水,醇法除多糖、蛋白质等水溶性杂质；,醇,水法除树脂、叶绿素等水不溶性杂质；,醇,醚法或醇,丙酮法使苷类成分，而脂溶性树脂等杂质则存留在母液中。,2.1,物质溶解度差别,（,2,）对酸性、碱性或两性有机化合物来说，通常通过加入酸、碱以调节溶液的,pH,，以改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。,如：酸提碱沉法，碱提酸沉法等。,1,、结晶及重结晶法,2,、溶剂分离法,2.1,物质溶解度差别,（,3,）沉淀法：酸性或碱性化合物还可通过加入某种沉淀试剂使之生成水不溶性的盐类沉淀等析出。,如加入铅盐、雷氏铵盐等。,1,、结晶及重结晶法,2,、溶剂分离法,2.1,物质溶解度差别,第二章 提取分离和鉴定方法,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,1,两相溶剂萃取法,2,液,液分配柱色谱,3,加压相色谱法,1,两相溶剂萃取法,（,1,）原理：利用混合物中各成分在,两相互不相溶,的溶剂中,分配系数的不同,而实现分离。萃取时如果各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率越高。,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,1,两相溶剂萃取法,（,2,）各种萃取方法：, 简单萃取：,利用分液漏斗进行两相溶剂萃取。,逆流连续萃取法：,是一种连续的两相溶剂萃取法。其装置可具有一根、数根或更多根的萃取管。,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,1,两相溶剂萃取法,（,2,）各种萃取方法：,逆流分配法（,CCD,）：,又称逆流分溶法、逆流分布法或反流分布法，与两相溶剂逆流萃取法原理一致，对于分离具有非常相似性质的混合物效果较好。,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,1,两相溶剂萃取法,（,2,）各种萃取方法：,液滴逆流分配法（,DCCC,）：,本法必须选用能生成液滴的溶剂系统，且对高分子化合物的分离效果较差，处理样品量小，并要有一定的设备，操作较繁琐。,一般,50,时，简单萃取即可分离，,50,时，则易采用逆流分溶法。,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,2,液,液分配柱色谱：,原理：分配原理,支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素粉等,正相分配色谱：,固定相：水、缓冲溶液,流动相：固定相饱和的氯仿、乙酸乙酯、丁醇等弱极性有机溶剂,洗脱顺序：化合物极性越小，越先出柱；反之，化合物极性越大，越后出柱。,应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,2,液,液分配柱色谱：,应用：通常用于分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物。,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,3,液,液分配柱色谱：,反相分配色谱：,固定相：石蜡油、化学键合固定相,流动相：固定相饱和的水或甲醇等强极性有机溶剂,洗脱顺序：化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。,应用：适合于分离脂溶性化合物，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等。,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,常用反相硅胶薄层色谱及柱色谱的填料是普通硅胶经下列方式进行化学修饰，键合上长度不同的烃基（,R,）、形成亲油表面而成。其中以硅烷化键合型最为常用，其根据烃基（,R,）长度（,C2H5,、,C8H17,、,C18H37,、）分别命名为：,RP2,、,RP8,、,RP18,。三者,亲脂性,强弱顺序如下：,RP18,RP8,RP2,。,键合固定相的作用并非只是分配，也有一定的吸附作用。,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,加压相色谱法又分为：,快速柱色谱,（约,2.02,105Pa,），,Lobar,低压柱色谱,（,5.05,105Pa,），,中压柱色谱,（,5.05,20.2,105Pa,），,分析用,HPLC,，,制备用,HPLC,（,20.2,105Pa,）,。,固定相：,RP2,、,RP8,或,RP18,流动相：,水,甲醇或水,乙腈,洗脱顺序：,化合物极性越大，越先出柱；反之，化合物极性越小，越后出柱。,应用：,通常用于分离水溶性或极性较大的成分，如苷类、酚性化合物等。,3,加压相色谱法,2.2,物质在两相溶剂中的分配比不同,2.3,物质的吸附性差别,以固,液吸附用的最多,;,物理吸附,（硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱）,;,化学吸附,（黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等）,;,半化学吸附,（聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附与化学吸附之间）之分。,1,物质的吸附规律,2,极性及其强弱判断,3,吸附柱色谱法用于物质的分离,4,聚酰胺吸附色谱法,5,大孔吸附树脂,2.3,物质的吸附性差别,1,物质的吸附规律,（,1,）物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱大体遵循“,相似者易于吸附,” 的经验规律。,（,2,）被分离的,物质与吸附剂、洗脱剂,共同构成吸附层析的三要素，彼此紧密相连。,2.3,物质的吸附性差别,1,物质的吸附规律,常用的,非极性,吸附剂：活性炭。,对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的极性越小，洗脱能力越强。,2.3,物质的吸附性差别,常用的,极性吸附剂,：硅胶、氧化铝。,硅胶显,微酸性,，适于分离酸性和中性化合物，分离生物碱时需在流动相中加入适量的有机碱；,氧化铝呈,碱性,，适于分离生物碱等碱性成分，不宜用于分离有机酸、酚性等酸性成分。,1,物质的吸附规律,2.3,物质的吸附性差别,硅胶、氧化铝均为极性吸附剂，故有以下特点：,被分离物质极性越强，吸附力越强。强极性溶质将优先被吸附。,溶剂极性越弱，则吸附剂对溶质的吸附能力越强。随溶剂极性的增强，则吸附剂对溶质的吸附力将减弱。,当加入极性较强的溶剂后，先前被硅胶或氧化铝所吸附的溶质可被置换而洗脱出来。,1,物质的吸附规律,2.3,物质的吸附性差别,2,极性及其强弱判断,（,1,）一般化合物的极性按下列官能团的顺序增强：,CH2,CH2,，,CH2=,CH2,，,OCH3,，,COOR,，,C=O,，,CHO,，,NH2,，,OH,，,COOH,（,2,）溶剂的极性可大体根据介电常数的大小来判断。,介电常数越大，则极性越大。,一般溶剂的介电常数按下列顺序增大：,环己烷（,1.88,），苯（,2.29,），无水乙醚（,4.47,），氯仿（,5.20,），乙酸乙酯（,6.11,），乙醇（,26.0,），甲醇（,31.2,），水（,81.0,）,2.3,物质的吸附性差别,3,吸附柱色谱法用于物质的分离,以硅胶或氧化铝为吸附剂进行柱色谱分离时：,（,1,）尽可能选用极性小的溶剂装柱和溶解样品，或用极性稍大的溶剂溶解样品后，以少量吸附剂拌匀挥干，上柱。,（,2,）一般以,TLC,展开时使组分,Rf,值达到,0.20.3,的溶剂系统作为最佳溶剂系统进行洗脱。实践中多用混合的有机溶剂系统。,2.3,物质的吸附性差别,2.3,物质的吸附性差别,3,吸附柱色谱法用于物质的分离,（,3,）为避免化学吸附，酸性物质宜用硅胶、碱性物质宜用氧化铝作为吸附剂进行分离。通常在分离酸性（或碱性）物质时，洗脱溶剂中常加入适量的醋酸（或氨、吡啶、二乙胺），以防止拖尾、使斑点集中。,2.3,物质的吸附性差别,4,聚酰胺吸附色谱法,（,1,）原理：,氢键吸附。,一般认为系通过分子中的酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪酸上的羰基形成氢键缔合而产生吸附。吸附强弱取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力。,2.3,物质的吸附性差别,（,2,）吸附能力的强弱,通常化合物在水溶剂中大致有以下规律：,形成氢键的基团数目越多，则能力越强。,成键位置对吸附能力也有影响。易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附响应减弱。,4,聚酰胺吸附色谱法,2.3,物质的吸附性差别,分子中芳香化程度高，则吸附性增强；反之，则减弱。,一般情况下，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱致强的大致顺序如下：,水,甲醇,乙醇,氢氧化钠水溶液,甲酰胺,二甲基甲酰胺,尿素水溶液,其中，最常应用的洗脱系统是：乙醇,水,4,聚酰胺吸附色谱法,2.3,物质的吸附性差别,4,聚酰胺吸附色谱法,（,3,）应用：,特别适合于酚类、黄酮类化合物的制备和分离。,脱鞣质处理, 对生物碱、萜类、甾类、糖类、氨基酸等其他极性与非极性化合物的分离也有着广泛的用途。,2.3,物质的吸附性差别,5,大孔吸附树脂,通常分为极性和非极性两类。,（,1,）原理：,吸附性和分子筛性相结合。吸附性是由范德华引力或氢键引起的。分子筛是由于其本身多孔性结构产生的。,2.3,物质的吸附性差别,5,大孔吸附树脂,（,2,）影响因素：,一般非极性化合物在水中易被非极性树脂吸附，极性化合物在水中易被极性树脂吸附。糖是极性水溶性化合物，与,D,型非极性树脂吸附作用很弱。,物质在溶剂中的溶解度大，树脂对此物质的吸附力就小，反之就大。,2.3,物质的吸附性差别,5,大孔吸附树脂,（,3,）应用：,广泛应用于化合物的分离与富集工作中。如：苷类与 糖类的 分离，生物碱的精制，多糖、黄酮、三萜类化合物的分离等。,（,4,）洗脱液的选择：,洗脱液可使用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等。最常用的是乙醇,水。,2.3,物质的吸附性差别,2.4,物质分子大小,1,凝胶过滤法,（,1,）原理：,分子筛原理。即利用凝胶的三维网状结构的分子筛的过滤作用将化合物按分子量大小不同进行分离。,（,2,）出柱顺序：,按分子由大到小顺序先后流出并得到分离。,（,3,）常用的溶剂：,碱性水溶液（,0.1mol/L NH4OH,）含盐水溶液（,0.5mol/L,NaCl,等）,醇及含水醇，如甲醇、甲醇,水,其他溶剂：如含水丙酮，甲醇,-,氯仿,1,凝胶过滤法,（,4,）凝胶的种类与性质：,种类很多，常用的有以下两种：,Sephadex,-G,：只适用于水中应用，且不同规格适合分离不同分子量的物质。,Sephadex,LH-20,：为,Sephadex,G-25,经羟丙基化后得到的产物，具有以下两个特点：具有分子筛特性，可按分子量大小分离物质；在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配色谱的作用，适合于不同类型有机物的分离。,应用最广。,2.4,物质分子大小,2,膜过滤法,（,1,）概念：膜过滤法是一种用天然或人工合成的膜，以外界能量或化学位差为推动力，对双组分或多组分的溶质和溶剂进行分离、分级、提纯或富集的方法。,（,2,）分类：膜过滤技术主要包括渗透、反渗透、超滤、电渗析、液膜技术等。,2.4,物质分子大小,3,透析法：,透析法是膜过滤法中的一种。,（,1,）原理：,透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜、而大分子物质不能透过半透膜的性质，以达到分离的目的，本质上是一种分子筛作用。,2.4,物质分子大小,3,透析法：,（,2,）应用：,对于生物大分子，一般可以通过透析法进行浓缩和精制。如药用酶的精制。,分离和纯化皂苷、蛋白质、多肽、多糖等大分子物质，可将其留在半透膜内，而将如无机盐、单糖、双糖等小分子的物质透过半透膜，进入膜外的溶液中，而加以分离精制。,2.4,物质分子大小,2.5,物质解离程度,具有酸性、碱性、两性基团的化合物在水中多呈解离状态，据此可用离子交换法进行分离。,原理：离子交换原理,固定相：离子交换树脂,流动相：水或含水溶剂,洗脱液：强酸性阳离子交换树脂（,H,型）,稀氨水洗脱,强碱性阴离子交换树脂（,OH,型）,稀氢氧化钠洗脱,1,分类：根据交换基团不同分为：,阳离子交换树脂,强酸性（,SO3-H+,）,弱碱性（,COO-H+,）,阴离子交换树脂,强碱性,N+,（,CH3,）,3Cl,弱碱性（,NH2,及仲胺、叔胺基）,2.5,物质解离程度,2,应用：,用于不同电荷离子的分离，如水提取物中的酸性、碱性、两性化合物的分离。,用于相同电荷离子的分离，如同为生物碱，但碱性强弱不同，仍可用离子交换树脂分离。,2.5,物质解离程度,2.6,物质的沸点,分馏法,1,概念： 分馏法是利用中药中各成分沸点的差别进行提取分离的方法。一般情况下，液体混合物沸点相差,100,以上时，可用反复蒸馏法；沸点相差,25,以下时，需用分馏柱；沸点相差越小，则需要的分馏装置越精细。,2,应用：挥发油、一些液体生物碱的提取分离常采用分馏法。,第三节 结构研究方法,在结构研究前必须首先确定化合物的纯度。纯度检查方法很多，如检查有无均匀一致的晶形，有无明确、敏锐的熔点等。,但是最常应用的还是各种色谱方法，如,TLC,或,PC,等。一般，只有当试样在三种展开系统中均呈现单一斑点时方可确认其为单一化合物。,另外，气相色谱（,GC,）也是判断物质纯度的一种重要方法，但只适用于在高真空和一定加热条件下能够气化而不被分解的物质。,1,、化合物的纯度测定,第三节 结构研究方法,2,、结构研究的主要程序,初步推断化合物的类型,-,测定分子式，计算不饱和度,-,确定分子中含有的官能团，或结构片段，或基本骨架,-,推断并确定分子的平面结构,-,推断并确定分子的立体结构（构型、构象）,第三节 结构研究方法,3,、结构研究中采用的主要的方法,1,、确定分子式，计算不饱和度,2,、质谱（,MS,）,可用于确定分子量及求算分子式和提供其它结构信息。此外，还可由分子离子丢失的碎片大小或由碎片离子的,m/z,值以及裂解特征推定或者复核分子的部分结构。,第三节 结构研究方法,3,、红外光谱,分子中价键的伸缩及弯曲振动将在光的红外区域，即,4000,625cm-1,处引起吸收。测得的吸收图谱叫红外光谱。许多特征官能团可据此进行鉴别。某 些情况下，红外光谱可用于区别芳环的取代图式及构型、构象等。,3,、结构研究中采用的主要的方法,第三节 结构研究方法,4,、 紫外,-,可见吸收光谱,UV,光谱对于分子中含有共轭双键、,a, b-,不饱和羰基（醛、酮、酸、酯）结构的化合物以及芳香化合物的结构鉴定来说是一种重要的手段。通常主要用于推断化合物的骨架类型；某些场合下，如香豆素类、黄酮类等化合物，它们的,UV,光谱在加入某种诊断试剂后可因分子结构中取代基的类型、数目及排列方式不同而发生不同的改变，故还可用于测定化合物的精细结构。,3,、结构研究中采用的主要的方法,第三节 结构研究方法,5,、 核磁共振谱,(1) 1H-NMR,测定中通过化学位移（,）、谱线的积分面积以及裂分情况（重峰数及偶合常数,J,）可以提供分子中,1H,的类型、数目及相邻原子或原子团的信息，对有机化合物的结构测定具有十分重要的意义。,(2) 13C-NMR,噪音去偶谱（,Proton noise,ecoupling,spectrum,）也叫全氢去偶（,Proton complete decoupling,，,COM,）或宽带去偶（,Broad band decoupling,，,BBD,）。所有的,13C,信号在图谱上均作为单峰出现，故无法确定其上连接的,1H,数，对判断,13C,信号的化学位移十分方便。,DEPT,（,Distortion1ess enhancement by polarization transfer,）,DEPT,法系通过改变照射,1H,核的脉冲宽度（,）或设定不同的弛豫时间（,De1ay time,，,2D3,），使不同类型的,13C,信号在谱图上呈单峰并分别呈现正向峰或倒置峰，故灵敏度高，信号之间很少重叠，目前已成为,13C-NMR,谱的一种常规测定方法。,3,、结构研究中采用的主要的方法,