第四章 蛋白质的物理化学性质

Venkey,Venkey,Venkey,Venkey,Venkey,Venkey,Venkey,Venkey,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第四章,蛋白质的物理化学性质,重点与难点,热力学相关函数：熵、焓、热容量,蛋白质折叠相关作用力,蛋白质的折叠过程,第一节 热力学函数与蛋白质构象,一、热力学函数与热力学平衡,内能：,组成物体的所有分子的无规则运动的,动能,与分子间相互作用的,势能之和,。,焓,(enthalpy),：,是一个系统的,热力学,参数。,它描述的是体系的一个状态性质，,焓的变化是系统在,等压可逆过程,中所吸收的热量的度量。,用符号,H,表示，即,H=,E+pV,E,为系统内能，,p,为其压强，,V,则为体积,熵（,S,）,是度量体系,混乱度,的热力学函数,从微观的角度来看，熵具有统计意义，它是体系微观状态数,(,或无序程度,),的一种量度。,熵值小,，对应比较,有秩序,的状态,熵值大,，对应比较,无秩序,的状态,内能,(E),和,焓,(H),是,体系自身,的性质，要认识它们，需凭借体系和环境间热量和功的交换从外界的变化来推断体系,E,和,H,的变化值。,熵,也是如此，体系在一定状态下有一定的值，当体系发生变化时要用可逆变化过程中的热温熵来衡量它的变化值。,吉布斯自由能,(Gibbs free,energy,G,):,亦称吉布斯函数，它是定温定压下系统的状态函数。可以用公式表示为：,G=H-TS=,E+pV,-TS,其中，,T,为,绝对温度,；,S,为体系的,熵,注意,:,吉布斯自由能是,体系的性质,，它的大小只决定于体系的,始态和终态,，而与变化的途径无关,(,即与可逆与否无关,),。,二、热容量,热容量,:,指系统在某一过程中，温度升高（或降低）,1,所吸收（或放出）的热量,。,热容量的单位是,J/K,。,系统的热容量与状态的转变过程有关，与它所包含的物质的质量,成正比,，不同过程的热容量不同。,系统吸收的热量为,正值,，释放的热量为,负值,使用,微分扫描量热仪,直接测定热容量变化,三、,vant Hoff,焓,Vant,Hoff,规则,：荷兰科学家范特霍夫 提出,温度每升高,10 K,反应速度增加,2-4,倍,当溶液中的活性状态,N,与失活状态,U,处于平衡时，平衡常数,K=U/ N,取决于两种自由能之差,G=G,U,G,N,。,自有能差,G,也可以用焓差,H=H,U,H,N,和 熵差,S=S,U,S,N,表示为：,G = H,TS,于是,： ,RTlnK,= H,0,TS,0,由此看出，平衡常数对温度的依赖关系可以用来估计,H,的大小。,H,0,和,S,0,分别表示标准状态下的焓和熵。,所以,lnK,=,H,0,/ RT+S,0,/R,即,lnK,=,（,H,0,/ R,）（,1/T,）,+S,0,/R,以,lnK,的实验值对,1/T,作图，可以得到一条直线，这条线上任何点上的斜率为,Vant,Hoff,焓（,H,0,）与,R,之比。,Vant,Hoff,焓主要用于,两态转变,模型的分析,四、蛋白质构象与热运动,构象,:,由于单键基本自由旋转以及键角有一定的柔性，一种具有相同结构和构型的分子在空间里可采取多种形态，分子所采取的特定形态称为构象。,构象角,:,围绕单键旋转的角度称为构象角,它决定了多肽链的一个结构 。,热运动,:,是指蛋白质溶液中所有分子的不停运动，包括了,分子相对于容器的运动,和,分子内部各部分之间的相对运动,。,热运动在溶液中和多肽链的各部分之间传播，主要是通过,多肽链各部分之间,和,多肽链与溶液分子,之间的相互作用来实现的。,体系达到热力学平衡时，在空间的一定范围内和一定间隔内的平均热运动能量不再发生变化，蛋白质处于,天然态,。,五、热力学参数在分子水平上的解释,从,分子的相互作用,来理解蛋白质天然结构的稳定性,为了使蛋白质折叠起来，就需要通过多肽链各部分间相互作用所引起的内能的减少来抵消构象熵减少带来的自由能增加。,G=H-TS=E+pV-TS,键 键能,/,（,kj,/mol,）,氢 键,13,30,范德华力,4,8,疏水作用,12,20,盐 键,12,30,二 硫 键,210,熵,是水溶液中形成疏水基团间结合的主要热动力学驱动力。,稳定蛋白质三维结构的作用力：,氢键,、,范德华力,、,疏水作用力和盐键,（离子键）及,共价二硫键,。,1,静电相互作用,蛋白质的折叠态与退折叠态的空间结构不同，在水溶液中，表现为同一个可电离基团附近环境的有效介电常数的变化，于是它们的,pka,值也不同。,残基,pka,值的移动很小，但蛋白质大分子可电离集团相当多，小,pka,值移动的大量积累对蛋白质稳定性很重要。,静电相互作用对折叠稳定性潜在的重要性,2,范德华相互作用,范德华力,（,van,der,Waals,interaction,）,在物质的聚集态中，分子间存在着一种较弱的吸引力，当两个不带电荷的原子非常靠近时，它们的,电子云,相互作用，核周围电子位置的随机变化可能产生一个,瞬间电偶,。该电偶能够诱导邻近的原子产生一个短暂的反向电偶。这,两个电偶,之间会产生微弱的引力,从而拉近两个原子核。这种微弱的吸引力即为,范德华力,。,范德华力组成：,取向力,:,当极性分子相互接近时，它们的固有偶极将同,极相斥而异极相吸，定向排列，产生分子间的作用力,诱导力,:,当极性分子与非极性分子相互接近时，非极性分子在,极性分子的固有偶极作用下，发生极化，产生诱导偶,极，然后诱导偶极与固有偶极相互吸引而产生分子间作,用力,色散力,:,非极性分子之间，由于组成分子的正、负微粒不断运,动，产生瞬间正、负电荷重心不重合，而出现瞬时偶,极。瞬时偶极之间的相互作用力 。,3.,氢键（,Hydrogen Bonding,）,由电负性原子与氢形成的基团如（,N-H,和,O-H,）具有很大的偶极矩，成键电子云分布偏向负电性大的原子，因此氢原子核周围的电子分布就少，正电荷的氢核,(,质子,),就在外侧裸露。这一正电荷氢核遇到另一个电负性强的原子时，就产生静电吸引，即,氢键,。,在生物相中最常见的氢键是,羟基（,-OH,）和氨基（,-NH,）,之间，其稳定性递减次序大约是,OHN,XON,HN-NHO,，这种键可以发生在分子间、分子内或者二者的结合。,氢键对蛋白质天然结构的稳定作用只能来自于水,-,水氢键,+,链内氢键，和水,-,肽链氢键两种情况下的自由能之差。蛋白质中有许多种氢键。,分 类,OH,/cm,-1,R,（,O,O,）,/nm,实 例,弱氢键,3200,0.270,H,2,O(,水、水合物,),R,OH(,醇、酚,),中强氢键,2800,3100,0.260,0.270,R,COOH(,羧酸,),强氢键,700,2700,0.240,0.260,MH(RCOO),2,(,酸盐,),氢键在蛋白折叠过程中的作用,杜克大学（,Duke University,）,的化学家们通过改变蛋白质关键部位的单个原子，发现了相对作用力较弱的氢键在使线形蛋白折叠成能发挥生物活性的最稳定结构中有重要作用,PANS,2006,4.,疏水效应（,hydrophobic,effect,）,疏水效应,:,水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基埋藏在分子的内部。,蛋白质溶液系统的,熵增加,（熵变化,S,为正值）是疏水作用的主要动力。,疏水作用是疏水基团或疏水侧链出自避开水的需要而被迫接近。要使疏水氨基酸,R,基团排除水而埋在内部，至少需要两层二级结构。两种简单形式，,-,环（,-loop,）和,-,角（,-corner,）。,A,B,吲哚与苯环,边对面,T,型接触,恶唑环与苯环,面对面平行接触,疏水作用的方向倾斜性实例图,5.,二硫键,二硫键,(,共价键,),为了确定蛋白质的一级结构，须在,2-,巯基乙醇、二硫苏糖类、巯基乙酸等硫化合物与尿素等变性剂同时存在下将二硫键打开,RNA,酶复性实验发现二硫键对肽链的正确折叠不是必要的，但它对,稳定折叠态结构,作出贡献。,6.,盐桥或离子键,盐桥或离子键又称盐键，它是正电荷与负电荷之间的一种静电相互作用。,盐键的形成既是静电相互作用的过程也是熵增的结果。,第二节 突变、稳定性和折叠,一、体外突变技术,概念,:,体外突变技术是用,酶学方法和化学方法,剪切或合成,DNA,，将,突变导入到克隆化的基因中,，再将,改变的基因重新克隆到生物体中,分析该基因的功能变化的一项技术。,分类,:,随机突变,定点突变,3,.,应用,:,研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系 。,4.,具体事例：,改进,-,抗胰蛋白酶,-,抗胰蛋白酶与,嗜中性白细胞弹性硬蛋白酶,结合形成复合物,将后者在,Met358,和,Ser359,之间切断,Met358 Val358,提高重组干扰素的专一活性,- IFN,基因在,E.coli,中表达,产物的抗病毒活性为天然糖基化蛋白的,10%,3,个,Cys,Cys31-Cys141,Cys17 Ser17,提高,T4,溶菌酶的热稳定性,T4,溶菌酶,(,Cys54,-,Cys97,),Ile3,Cys3 -Cys97,热稳定性,Cys21 Cys142,稳定性,酶活性,磷酸丙糖异构酶的结构改造提高其稳定性,高温：,Asn Asp Gln Glu,失活,Asn14,、,Asn78 Thr,或,Ile,热稳定性,二、突变与热稳定性,1.,定点突变对蛋白质稳定性的影响,氨基酸的,插入和删除,、,寡聚化,和,脯氨酸取代,这三因素可以稳定,个别嗜热蛋白。,2.,导致热稳定性的因素,堆积、寡聚化、氨基酸插入和删除、脯氨酸取代、螺旋含量、螺旋倾向、极性表面积、,氢键,和,盐桥,3.,突变试验增加蛋白质的亲盐性,例如亲盐的苹果酸脱氢酶中的唯一的,Glu,替换为,Arg,三、蛋白质折叠,1 .,蛋白质折叠研究的概况,蛋白质折叠,:,蛋白质的一级结构并没有生物活性，结构决定功能，一维的线型氨基酸序列转化为具有特征三维结构的天然蛋白质才具有生物活性，这种自我组装的过程被称为,蛋白质折叠,。,追踪蛋白质重折叠的全过程的实验方法：,快速核磁共振，快速光谱技术（荧光、圆二色谱）,蛋白质折叠技术的研究应当将蛋白质结构研究与折叠过程动力学研究相结合以促进对蛋白质折叠机理的认识。,“,新生肽的折叠,”,问题与中心法则,protein,polypeptide,翻译,折叠,退折叠,失活或变性,转录,逆转录,?,DNA,RNA,2,蛋白质折叠机制,Anfinsen,经典的“热力学假说”,天然蛋白质多肽链采取的构象是在一定环境条件下热力学上最稳定的结果，采取天然构象的多肽链和它所处的一定环境条件整个系统的,总自由能最低,。蛋白质多肽链折叠的过程，也就是从众多可能的构象中寻找系统,自由能最低,的状态的过程。,Wolynes,提出粗糙能量地形面的观点,即折叠是在一个折叠漏斗中进行的。蛋白质折叠的过程就象多溪流水从具有复杂地形结构的山坡流下一样，而不仅是一溪流水从一单个山谷中流下。,折叠的能量漏斗模型形象地描绘了折叠过程的多路径性,图 能量漏斗模型,蛋白质折叠过程假设,肽链中的局部肽段先形成一些构象单元即,螺旋、,折叠和,转角等二级结构，然后再是二级结构的组合、排列形成蛋白质的三级结构。,首先是肽链内部的疏水作用起作用，产生一个塌陷过程，然后经调整，形成不同层次的结构。,不同的假设，都有一个所谓,“,熔球态,”,的中间状态,熔球体：,在折叠中，第一个可观测到的中间体是未折叠多肽卷折成局部有组织的球状态。,分子伴侣,与,蛋白质折叠,分子伴侣的功能,(1),可调节性地阻碍多肽链集聚,(2),具有折叠互补功能,即可使已形成的蛋白质集聚体重折叠和恢复其水溶性,(3),可以促进折叠错误的蛋白质降解,“,有帮助的肽链的自发折叠和组装,”,3.,蛋白质折叠研究的最新进展,巴西圣保罗州立大学,美国纽约州立石溪大学,以及中科院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室的研究人员在之前研究的基础上发现了,扩散,(diffusion),在蛋白折叠动力学方面的重要作用。,扩散系数,随着蛋白质天然状态折叠级数的增加而,减小,，这主要是由于构造空间约束的一种紧密状态的塌陷造成的。它改变折叠动力学的比率和动力学路径。,PNAS,美国康奈尔大学和,Scripps Research Institute,的研究者发现：沿着肽链具有很多疏水基团依赖自身折叠的位点，生成了小型的非极性疏水袋，蛋白质沿着包含有非极性基团或者含有不带电荷分子的氨基酸链处开始折叠，并通过这些非极性基团的组合进一步折叠。,PNAS,，,2006,4.,蛋白质折叠研究意义及应用前景,蛋白质折叠研究意义,蛋白质折叠机制的阐明有助于揭示生命体内,第二套遗传密码,的理论意义。,最终阐明遗传信息传递的全过程，完全建立分子生物学的中心法则。,应用前景,（,1,）对包涵体的复性有重要帮助,（,2,）,DNA,重组和多肽合成技术的发展使我们能够按照自己的意愿设计较长的多肽链,（,3,）深入了解蛋白质折叠与错误折叠的关系对于这些疾病的致病机制的阐明以及治疗方法的寻找将大有帮助,（,4,）蛋白质折叠机制的阐明是我们对于蛋白质相互作用、配体与蛋白质的作用等结构与功能关系研究的基础,（,5,）提高蛋白质结构预测的可靠性,第三节 蛋白质折叠热力学与动力学,蛋白质折叠内容：,（,1,）变性的蛋白质或多肽链的折叠,（,2,）通过三联密码翻译成的氨基酸序列链,(,新生肽链,),的折叠,蛋白质折叠的研究方法,（,1,）,X-,射线晶体衍射,（,2,）同源模建方法,（,3,）从蛋白质序列出发，直接预测蛋白质的结构？,一、蛋白质折叠的热力学研究,Anfinsen,认为,蛋白质的折叠结构在一定条件下是热力学最稳定的,即通常的自由能极小的状态。,环境条件不同，热力学平衡移动的方向就不同，可以向天然态方向移动，也可以向退折叠方向移动，就有了平衡态的折叠和退折叠转变过程。,通过,熵函数和吉布斯自由能,简要分析蛋白质折叠结构中所蕴涵的热力学基本原理,典型的蛋白质的折叠漏斗,（引自,Patricia L. Clark,）,能 量,未折叠状态,中间状态,天然状态,蛋白质折叠研究的漏斗模型,1.,熵效应,熵增加原理：,在绝热条件下，体系发生不可逆过程时，其熵值增大；而体系发生可逆过程时，其熵值不变；不可能发生熵值减小的过程。,疏水作用,的主要动力来自于蛋白质溶液体系的,熵增效应,。,例如,疏水作用是,肌红蛋白,多肽链折叠的主要驱动力,使水介质中球状蛋白质的折叠总是倾向于把疏水残基隐藏在分子的内部，其在稳定蛋白质的三维结构方面占有突出的地位。,2.,吉布斯自由能变化,G,总,=,H,链,+,H,溶剂,-,T,S,链,-,T,S,溶剂,折叠态蛋白质与伸展态相比，是一种高度有序化的结构，因此,S,链是负数，则,-,T,S,链为正值。,折叠态蛋白质中疏水侧链主要是通过范德华力彼此相互作用。,对于典型的蛋白质来说，对折叠结构的稳定性做出单项最大贡献的是,疏水残基引起的,S,溶剂,。,3,折叠,/,退折叠转变,蛋白质折叠归根结底取决于在某温度（,T,）下折叠态（,F,）和伸展态（,U,）之间的吉布斯自由能差,（,G,）：,G=G,F,G,U,=H,TS=,（,H,F,H,U,）,T,（,S,F,S,U,）,在伸展态中多肽主链及其侧链是与溶剂水（也称介质水或环境水）相互作用的，因此折叠时自由能变化（,G,）的任何测量必须考虑,多肽链和溶剂,两者对焓变化（,H,）和熵变化（,S,）的贡献：,G,总,=H,链,H,溶剂,TS,链,TS,溶剂,极性侧链,H,链是正值,，而,H,溶剂是负值,。,对蛋白质的极性侧链来说，,G,总接近于零，对蛋白质折叠不作实质性的贡献。,蛋白质,条 件,G/(kJ,mol,-1,),H/(kJ,mol,-1,),S/( J,k,-1,mol,-1,),核糖核酸酶,A,pH2.5,-7.3,-238,-774,胰凝乳蛋白酶,pH3.0,-32,-163,-439,肌红蛋白,pH9.0,-57,-157,-397,-,乳球蛋白,5mol/L,尿素,-1.7,+88,+301,几种蛋白质折叠的热力学数据,在不同蛋白质中总熵变化（,S,链,+S,溶剂）和总焓变化对折叠结构的稳定性所做的贡献的份额是不同的,S,溶剂,S,链,H,溶剂,H,链,G,总,能量,0,（,a,）真空中的蛋白质,伸展态,折叠态,能量,0,（,b,）水溶剂中的疏水侧链,伸展态,折叠态,能量,0,（,c,）水溶剂中的极性侧链,伸展态,折叠态,决定球状蛋白质折叠自由能的各项的贡献方式的图解,折叠结构在生理条件下是自由能最低的构象，因此多肽链的折叠是自发过程。,4.,量热法与折叠过程热力学,量热试验,是用一种微分扫描量热仪直接测定热容量的变化，还可以测定焓变、熵变。,典型的球蛋白退折叠微分描述量热曲线示意图（参考王大成等）,两边两条虚线分别代表天然态和退折叠态的热容量并已外推进入转变区；峰线下的面积即为转变潜热。,115,100,40,55,70,85,T/,0,20,40,60,cp/kJmol-1,N,U,二、蛋白质折叠的动力学研究,蛋白质折叠,线性多肽链的,一级结构,最终形成具有,三维 结构,特征并表现其,生物学功能的天然蛋白质,的 复杂过程。,蛋白质折叠的步骤,成核,变性蛋白,二级结构,结构域,折叠的交互式蛋白,折叠的活性单体,组装,交互式寡聚蛋白,活性寡聚蛋白,1,折叠动力研究技术与方法,Levinthal puzzle,：,假定每个氨基酸残基可能的构象状态数为,j,，一个有,N+1,个氨基酸残基，,N,个肽单位的完全去折叠蛋白质，其肽链可能获得的构象状态数为,j,N,。,例如,j=8,一个有,101,个氨基酸残基的较小的蛋白质，其肽链的可能构象状态为,8,100,（,10,89,）,如果构象之间的转换速率为,k,，蛋白分子经历全部构象的平均时间为：,=,（,Nk,）,-1,j,N,例如：,101,个氨基酸残基的蛋白质经历全部构象的时间多于,10,66,年。,蛋白质的折叠不是一个随机过程，而是通过特定的动力学途径达到天然构象，即动力学上最容易达到的构象。,吉布斯自由能,构 象,热力学控制,天然状态,吉布斯自由能,构 象,天然状态,非天然状态,蛋白质折叠的热力学控制和动力学控制,动力学控制,蛋白质天然构象的形成,蛋白质多肽链正确折叠原因,某些因素在蛋白质折叠的动力学过程中起控制作用 。,如：,I,型人类胰岛素生长因子（,IGF-I,）,枯草杆菌蛋白酶,(subtilisin),蛋白质折叠动力学控制的研究基础,-,热力学假说,蛋白质构象的研究方法,测定溶液中的蛋白质分子构象,测定晶体蛋白质分子构象,测定蛋白质构象的各种方法,方 法,提供的结,构信息,主要指标,主要设备,应 用,核磁共振,溶液中蛋白质分子构象；构象动力学,化学位移，谱线强度，自旋偶合常数,脉冲傅里叶,NMR,波谱仪,越来越多,圆二色性光谱法,二级结构,及其变化,椭圆度,圆二色性光谱仪,很多,荧光光谱,Tyr,或,Tyr,微区；构象变化,发射光谱，,量子产率,自动扫描荧光分光光度计,很多,紫外差示光谱法,Tyr,或,Tyr,微区；构象变化,不同波长,OD,双光路紫外分光光度计,很多,激光拉曼光谱法,二级结构,拉曼光谱峰,激光拉曼光谱仪,不够成熟应用比较困难,氢同位素交换,氢键数目，规则二级结构含量,与环境水不可交换的肽键氢的个数,1.,红外分光光度计,2,分子筛,+,氚测定,较少,X,射线衍射结构分析,多肽链上所有原子的空间排布，但氢原子除外,衍射点的强度和位置,高分辨率,X,射线衍射仪,很多,小角中子衍射,多肽链上所有原子的,空间排布,散射强度的分布,中子源；小角相机,刚起步,2.,过渡态,模拟的折叠过程,过渡态理论,是否适合于描述蛋白质分子的折叠退折叠过程 ？,3,折叠中间态,(1),熔球态（,molten globule,）,主要特征,:,天然态二级结构，但三级结构却不完整；,它比天然态有较多的疏水区域暴露；,当熔球态变性到伸展态时，温度跃迁消失。,例如,Goto,等发现，在强酸导致肽链完全伸展时，可以得到,-,乳球蛋白（,-Lactoglobulin,）、细胞色素,c,（,cytochromec,）及去辅基肌红蛋白（,apo-Mb,）的熔球态,。,蛋白质正确折叠过程中的阻碍,部分折叠的中间体在分子间疏水作用下而引起的聚集,脯氨酸残基的异构化,半胱氨酸错误配对而形成的二硫键连接,折叠病：,蛋白质分子的氨基酸序列没有改变，只是其结构或者说构象有所改变也能引起疾病。,疯牛病,朊病毒：正常蛋白的错误折叠形成的致病蛋白-朊病毒蛋白(,PrP),在脑组织中累积而引起的,蛋白质折叠病,朊病毒蛋白错误折叠, 大肠杆菌中有,DsbA,和,DsbC,蛋白，真核细胞中有二硫键异构酶,4,折叠的基本过程,折叠主要经历以下三种基本过程,接触形成,螺旋,-,链环转变,发卡（,-hairpin,）：,是普遍存在于球状蛋白中的一种结构，由一条构象伸展的多肽链弯曲后彼此靠近成反向平行而形成，含有,10,或,11,个氨基酸残基，两条等长的肽段依靠,1,6,个氢键连接。,谢谢！,