物质发光分析

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第七章 分子发光分析,分子发光包括分子荧光,(fluorescence),、分子磷光,(phosphorescence),、化学发光,(chemiluminescence),等。,1,处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。,这一机理同样适用于说明化学发光和生物发光的原理。,1,荧光和磷光的基本原理,2,电子激发态的多重度可用,M = 2S + 1,表示（或），多数分子含有偶数电子，根据,Pauli,不相容原理，分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自旋配对。假如分子中任一轨道都是自旋配对的，此时,S = 0,，所以分子的多重度,M = 1,，分子体系处于单重态，一般用符号,S,表示。大多数有机分子的基态处于单重态,一,.,分子荧光和磷光的产生,分子吸收和发射过程的能级图（,Jablonski,能级图）,两类电子激发态,3,分子吸收外界辐射能量后，如果电子在跃迁过程中不发生自旋方向上的变化，这时分子就处于激发的单重态，图中基态用,S,0,表示，第一电子激发单重态和第二电子激发单重态分别用,S,1,、,S,2,表示。,如果电子在跃迁过程中发生了自旋方向的改变，这时分子便具有两个自旋不配对的电子，此时,S = 1,，分子的多重度,M = 3,，即分子处于激发的三重态，用符号,T,表示。电子激发三重态分别用,T,1,、,T,2,表示，,= 0,、,1,、,2,、,3 ,表示基态和各个激发态的振动能级。,4,基态单重态 激发单重态 激发三重态,S,0,S,1,S,2,T,1,T,2,处于分立轨道上的非成对电子，自旋平行要比自旋配对更稳定些,(,洪特规则,),，因此在同一激发态中，三重态能级总是比单重态能级略低。,5,S,2,S,1,S,0,T,1,吸,收,发,射,荧,光,发,射,磷,光,系间跨越,内转换,振动弛豫,能,量,l,2,l,1,l,3,外转换,l,2,T,2,内转换,振动弛豫,Jablonski diagram,6,Jablonski diagram,7,传递途径,辐射跃迁,荧光,磷光,内转移,外转换,系间跨越,振动弛,豫,无辐射跃迁,激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大，,发光强度相对大；,荧光：,10,-7,10,-9,s,第一激发单重态的最低振动能级基态；,磷光：,10,-4,10 s,；第一激发三重态的最低振动能级基态；,2.,去活化过程,（,Deactivation,）,处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态 。这些过程包括：,8,(1),振动弛豫,(Vibration relaxation,，简写为,VR),在凝聚相体系中，被激发到激发单重态分子能通过与溶剂分子间的碰撞，以热的形式分子可将多余的振动能量传递给周围环境，而自身从,激发态的高振动能级跃迁至该电子能级的最低振动能级上,，这个过程称为振动弛豫。发生振动弛豫的时间为,10,12,S,数量级。,9,(2),内转换,(Internal conversion,，简写为,IC),当高电子能级中的低振动能级与低电子能级中的高振动能级发生重叠时，常发生电子从高电子能级以无辐射跃迁形式转移至低电子能级。这个过程称为内部转移。内部转移的时间为,10,11,S,10,13,S,数量级。,振动弛豫及内部转移的速率比由高激发态直接发射光子的速率快得多，所以，分子吸收辐射能后不管激发到哪一个激发单重态，都能通过振动弛豫及内部转移而跃迁到最低,(,第一,),激发单重态的最低振动能级。,10,3),外部转移,(External conversion,EC),激发态分子与溶剂分子或其它溶质分子相互碰撞，并发生能量转移的过程称为外部转移。外部转移能使荧光或磷光的强度减弱甚至消失，这种现象称为猝灭或熄灭。,11,(4),系间跨跃,(Intersystem Crossing, ISC),系间跨跃是指不同多重态之间的无辐射跃迁过程，它涉及到受激发电子自旋状态的改变。如由第一激发单重态,S,1,跃迁至第一激发三重态,T,1,，使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻的，但如果两个能态的能层有较大重叠时，,S,1,的最低振动能级与,T,1,的较高振动能级重叠，就有可能通过自旋一轨道偶合等作用实现这一跃迁。系间跨跃的速度很小，经历的时间较长。,12,(3),荧光发射,(Fluorescence emission,FE),处于激的单重态的电子经振动弛豫及内部转移后到达第一激发单重态,(S,1,),的最低振动能级,(v=0),后，以辐射的形式跃迁回基态,(S,0,),的各振动能级，这个过程为荧光发射。电于经过振动弛豫和内部转移的能量损失，因此荧光发射的能量比分子吸收的能量要小，荧光发射的波长比分子吸收的波长要长。第一发单重态最低振动能级的平均寿命为,10,9,10,4,S,，因此荧光寿命也在这一数量级。,13,5),磷光发射,(Phosphorescence emission),激发态的电子经系间跨跃后到达激发三重态，经过迅速的振动弛豫而跃迁至第一激发三重态的最低振动能级，然后以辐射形式跃迁回基态的各振动能级，这个过程为磷光发射。磷光发射的跃迁仍然是自旋禁阻的，所以发光速度很慢。磷光的寿命为,10,4,10 S,。因此，外光源照射停止后，磷光仍可持续一短时间。由于经过系间跨跃及,T,1,中振动弛豫丢失了一部分能量，所以磷光波长比荧光波长要长。,14,二荧光量子产率,荧光量子产率,(,),：表示物质发射荧光的能力,式中，,K,为荧光发射过程的速率常数，,K,i,为无辐射跃迁各种过程的速率常数之和可见，凡是使,k,F,增加，使其它去活化常数降低的因素均可增加荧光量子产率。通常，,k,F,由分子结构决定（内因），而,K,i,则由化学环境和结构共同决定。,15,三荧光的激发光谱和发射光谱,激发光谱,通过固定发射波长，扫描激发波长而获得的,荧光强度激发波长,的关系曲线，称为激发光谱。激发光谱反映了在某一固定发射波长下，不同激发波长激发的荧光相对效率。,发射光谱,(,也称荧光光谱,),通过固定激发波长，扫描发射波长所获得的,荧光强度发射波长,的关系曲线称为荧光发射光谱。它反映了在相同的激发条件系，不同波长处分子的相对发射强度。荧光发射光谱可用于荧光物质的鉴别。,16,图,2.,罗丹明,B,类化合物的激发,(1, ,em,= 640 nm,),和发射光谱,(2, ,ex,= 480 nm,),波长,/ nm,荧光强度,可确定最大激发及最大发射波长,17,四荧光发射光谱的特征,(1),斯托克斯,(,Stokes),位移,在溶液的荧光光谱中，所观察到的荧光发射波长总是大于激发光的波长。,Stokes,于,1852,年首次发现这种波长位移现象，故称,Stokes,位移。,*,斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定的,能量损失,。,Stokes,18,激发态分子由于振动弛豫及内转换的无辐射跃迁而迅速衰变到,S,1,电子态的最低振动能级，这是产生其位移的主要原因；,产生,Stokes,位移的原因：,荧光发射时，激发态的分子衰变到基态的各振动能级，此时，不同振动能级也发生振动弛豫至最低振动能级，也造成能量的损失；,溶剂效应以及激发态分子可能发生的某些反应，也会加大斯托克斯位移。,19,(2),荧光发射光谱的形状与激发波长无关,波长,/ nm,荧光强度,图,3.,不同激发波长下,4-,甲基伞形酮的荧光光谱,20,由于荧光发射是激发态的分子由,S,1,的最低振动能级跃迁回基态的各振动能级所产生的，所以不管激发光的能量多大，能把电子激发到哪种激发态，都将经过迅速的振动弛豫及内转换跃迁至,S,1,的最低,振动,能级，然后发射荧光。因此荧光发射光谱的形状与激发波长无关。,原 因,:,21,图,4.,芘的吸收光谱及荧光发射光谱,(3),荧光发射光谱与吸收光谱呈镜像对称,22,解释：能层结构相似性,荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。,吸收光谱是由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能层而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。,由于激发态和基态的振动能层分布具有相似性，因而呈镜像对称。,S,1,S,0,23,实验表明，大多数能发荧光的化合物都是由,*,或,n,*,跃迁激发，然后经过振动弛豫等无辐射跃迁，再发生, *,或, *,n,跃迁而产生荧光。而其中,*,时的摩尔吸光系数比,n,*,跃迁的大,10,2,10,3,倍，,*,跃迁的寿命,(10,7,10,9,),比,n,*,跃迁的寿命,(10,5,10,-7,),短，因此荧光发射的速常数,K,f,值较大，荧光发射的效率高。因此，, *,跃迁发射荧光的强度大。总之，,*,跃迁的类型是产生荧光的最主要跃迁类型。,跃迁类型：,五影响荧光强度的因素,24,共轭效应：,发生荧光,(,或磷光,),的物质，其分子都含有共键双键,(,键,),的结构体系。共轭体系越大， 电子的离域性越大，越容易被激发，荧光也就越容易发生，且荧光光谱向长波移动。大部分荧光物质都具有芳环或杂环，芳环越大，其荧光,(,或磷光,),峰越向长波移动，且荧光强度往往也较强。,25,化合物,量子产率,F,ex,（,nm,）,em,（,nm,）,苯,0.11,205,278,萘,0.29,286,321,蒽,0.46,365,400,26,刚性结构：,实验发现，多数具有刚性平面结构的有机化合物分子都具有强烈的荧光，因为这种结构可为减少分子的振动，使分子与溶剂或其他溶质分子之间的相互作用减少，即可减少能量处部转移的损失，有利于荧光的发射。而且平面结构可以增大分子的吸光截面，增大摩尔吸光系数，增强荧光强度。,27,0.92 0,1 0.18,28,取代基的影响,1),给电子取代基使荧光加强,属于这类基团的有,NH,2,，,NHR,，,NR,2,，,OH,，,OR,，,CN,等。由于这些基团上的,n,电子云几乎与芳环上的,电子轨道平行，因而实际上它们共享了共轭,电子，形成了,p,共轭，扩大共轭体系。因此，这类化合物的荧光强度增大,2),吸电子基团使荧光减弱而磷光增强,如,-COOH,、,-C=O,、,-NO,2,、,-NO,、,-X,等,.,这类基团都会发生,n,*,跃迁，属于禁阻跃迁，所以摩尔吸光系数小，荧光发射也弱，而,S,1,-T,1,的系间跨跃较为强烈，同样使荧光减弱，相应磷光增强。,29,4),重原子效应,荧光体取代上重原子后，荧光减弱，而磷光往往相应增强。所谓重原子取代，一般指的是卤素,(Cl,、,Br,和,I),原子取代，芳烃取代上卤素原子这后，其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，而磷光通常相应地增强，这种效应称为,“,重原子效应,”,。这种效应被解释为，由于重原子中，能级之间的交叉现象比较严重，使得荧光体中的电子自旋一轨道偶合作用加强，系间跨跃显著增加，结果导致荧强度减弱，磷光强度增强。,3),取代基位置的影响,取代基位置对芳烃荧光的影响通常为：邻位,、,对位取代者增荧光，间位取代者抑制荧光,(,CN,取代者例外,),。,以上为内在因素,.,30,外在因素,:,溶剂效应：, 溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变,*,及,n*,跃迁的能量）；,温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度 或“刚性”降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。,pH,值：具酸或碱性基团的有机物质，在不同,pH,值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因,pH,值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。,31,32,荧光猝灭：碰撞猝灭；静态猝灭；转入三重态的猝灭； 电子转移猝灭；自猝灭。,内滤作用和自吸现象：当溶液中存在能吸收荧光物质的激发光或发射光的物质时，也会使体系的荧光减弱，这种现象称为内滤作用。,如果荧光物质的荧光发射光谱在该物质的吸收光谱有重叠，当荧光物质浓度较大时，一部分荧光发射可被自身吸收， 从而使荧光强度降低，称为,自吸,。这种自吸现象也是一种内滤作用。,33,六定量分析,（,，,荧光量子,产,率,）,34,这种线性关系只有在极稀的溶液中才成立。对于较浓的溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度与浓度不成线性关系。,荧光强度大小与,:,（,1,）荧光体浓度成正比,;,（,2,）激发光强度成正比,;,（,3,）测量仪器有关,.,35,Absorbance,Deviation (%),0.001,0.1,0.01,1.1,0.05,5.5,0.10,10.6,0.20,19.9,Table. Deviation from linearity in the relation between fluorescence intensity and concentration for various absorbances,36,荧光仪器,第一单色器,或滤光片,记录仪,第二单色器,或滤光片,荧光,光源,激发,样品池,1,）光源：氙灯、高压汞灯、激光；,2,）样品池：石英（低荧光材料）；,3,）两个单色器：选择激发光单色器；,分离荧光单色器,；,4,）检测器：光电倍增管。,特殊点,：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,37,3.,荧光分析法的应用,(1),无机化合物的分析,与有机试剂配合物后测量；可测量约,60,多种元素。,铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；,氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；,铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；,铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；,铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定,(2),生物与有机化合物的分析,见表,38,39,40,荧光分析的特点：,灵敏度高：视不同物质，检测下限在,0.1 - 0.001,g/mL,之间。可见比,UV-Vis,的灵敏度高得多！,WHY,？,选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。,分析线性范围比吸收光谱法宽许多。,结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。,但采用探针技术可大大拓宽发光分析的应用范围。,41,磷光分析,1.,磷光的特点：,磷光波长比荧光的长,(T,1,S,1,),；,磷光寿命比荧光的长,(,磷光为禁阻跃迁产生，速率常数小,),；,磷光寿命和强度对重原子和氧敏感,(,自旋轨道耦合，使,k,ISC,增加,),。,2.,低温磷光（液氮）,由于磷光寿命长，,T,1,的非辐射跃迁（内转换）几率增加，碰撞失活（振动弛豫）的几率、光化学反应几率都增加，从而降低磷光强度。因此有必要在低温下测量磷光。同时要求溶剂：,(1),易提纯且在分析波长区无强吸收和发射；,(2),低温下形成具足够粘度的透明的刚性玻璃体。,42,3.,室温磷光,低温荧光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，,1974,年后发展了室温磷光,（,RTP,）,。,1,）固体基质：在室温下以固体基质（如纤维素等）吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。,2,）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。,利用胶束增稳、重原子效应和溶液除氧是该法的三要素。,43,三、磷光分析法的应用,稠环芳烃分析,采取固体表面室温磷光分析法快速灵敏测定稠环芳烃和杂环化合物（致癌物质）,农药、生物碱、植物生长激素的分析,药物分析和临床分析,见表,、磷光分析法的应用,44,45,化学发光分析,一定义,:,某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发到激发态，受激分子由激发态去激化跃回基态时以辐射形式发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程，称为化学发光。,46,化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分子激发所发射的光。任何一个化学发光反应都应包括化学激发和发光两个步骤，必须满足如下条件：,二化学发光分析的基本原理,（,1,）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源,于反应焓。,（,2,）要有有利的化学反应历程，使化学反应的能量至少,能被一种物质所接受并生成激发态。,（,3,）激发态能释放光子或能够转移它的能量给另一个分,子，而使该分子激发，然后以辐射光子的形式回到,基态。,47,化学发光效率,cl,，又称化学发光的总量子产率。它决定于生成激发态产物分子的化学激发效率,ce,和激发态分子的发射效率,em,。定义为：,三,.,化学发光效率,48,化学发光反应的发光强度,I,cl,以单位时间内发射的光子数表示。它与化学发光反应的速率有关。即,式中,I,cl,（,t,）表示,t,时刻的化学发光强度，它与化学发光效率及分析物参加反应的速率有关。而反应速率又与,反应分子浓度,有关。,I,CL,= K C,49,四、化学发光反应类型,1.,直接化学发光和间接化学发光,(1),直接发光,是被测物作为反应物直接参加化学发光反应，生成电子激发态产物分子，此初始激发态能辐射光子。,A + B,C* + D,C*,C + h,式中,A,或,B,是被测物，通过反应生成电子激发态产物,C*,，当,C*,跃迁回基态时，辐射光子。,(2),间接发光,是被测物,A,或,B,，通过化学反应生成初始激发态产物,C,*,，,C,*,不直接发光，而是将其能量转移给,F,，使,F,跃迁回基态，产生发光。,A + B,C* + D,C*+F,F* + E,F*,F + h,式中,C*,为能量给予体，而,F,为能量接受体。,50,2.,气相化学发光和液相化学发光,按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光；在两个不同相中进行则称为异相化学发光,。,51,（,1,）气相化学发光反应,a.,一氧化氮与,O,3,的发光反应,NO + O,3, NO,2,*,NO,2,* NO,2,+,h,发射的光谱范围：,600,875nm,，灵敏度,1ng/cm,-3,；,b.,氧原子与,SO,2,、,NO,、,CO,的发光反应,O,3, O,2,+ O （1000,C石英管中进行,）,SO,2,+ O + O SO,2,* + O,2,SO,2,* SO,2,* +,h,最大发射波长：,200nm,；灵敏度,1ng/cm,-3,；,52,O,3, O,2,+ O （1000,C石英管中进行,）,NO + O NO,2,*,NO,2,* NO,2,+,h,发射光谱范围：,400,1400nm,；灵敏度,1ng/cm,-3,；,氧原子与,CO,的发光反应：,CO + O CO,2,*,CO,2,* CO,2,+,h,发射光谱范围：,300,500nm,；灵敏度,1ng/cm,-3,；,氧原子与,NO,的发光反应：,53,c.,乙烯与,O,3,的发光反应,乙烯与,O,3,反应，生成激发态乙醛：,CH,2,O*,CH,2,O,+,h,最大发射波长：,435nm,；对,O,3,的特效反应；线性响应范围,1 ng/cm,-3,1g/cm,-3,；,54,b.,硫化物,挥发性硫化物,SO,2,、,H,2,S,、CH,3,SH、 CH,3,SCH,3,等,在富氢火焰中燃烧，产生很强的化学发光（蓝色）：,SO,2,+ 2H,2, S + 2H,2,O,S + S 2S,2,*,S,2,* S,2,+,h,发射光谱范围：,350,460nm,；,最大发射波长：,394nm,；,灵敏度：,0.2 ng/cm,-3,；,发射光强度与硫化物浓度的平方成正比。,55,2,）液相化学发光,用于此类化学发光分析的发光物质有鲁米诺、光泽碱、洛粉碱等。,鲁米诺在碱性溶液中与双氧水的反应过程,56,57,草酸二酯,+,高浓度双氧水,+,稠环芳烃,(,能量接受体,)+,金属离子,+,溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光,(,冷光源,),。,双（,2,，,4,，,6-,三氯苯基）草酸酯,58,五、化学发光的测量装置,化学发光分析法的测量仪器主要包括,样品室、光检测器、放大器和信号输出装置。,化学发光反应在样品室中进行，样品和试剂混合的方式有,不连续取样体系,，加样是间歇的。将试剂先加到光电倍增管前面的反应池内，然后用进样器加入分析物。另一种方法是,连续流动体系,，反应试剂和分析物是定时在样品池中汇合反应，且在载流推动下向前移动，被检测的光信号只是整个发光动力学曲线的一部分，而以峰高进行定量测量。,59,60,六化学发光的,特点：,1.,灵敏度极高,例：荧光素酶和磷酸三腺甙,(ATP),的化学发光分析，可测定,2,10,-17,mol,/L的ATP，即可检测出一个细菌中的ATP含量,;,2,.,仪器设备简单,不需要光源、单色器和背景校正；,3.,发射光强度测量无干扰,无背景光、散射光等干扰；,4.,线性范围宽,5.,分析速度快,缺点：可供发光用的试剂少；发光反应效率低（大大低于生物体中的发光）；机理研究少。,61,