创新化学实验与研究基金资助项目答辩

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,LOGO,LOGO,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Click to edit Master title style,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,创新化学实验与研究基金资助项目答辩,创新化学实验与研究基金资助项目答辩,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导,分离检测研究,专业：化学工程与工艺,导师：谢天尧 副教授,报告人：韦昱,07306407,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,实验及,讨论,研究方案,研究背景,选题意义,结论,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,选题意义,D-,丝氨酸是哺乳动物脑内,NMDA,型谷氨酸受体,(NR1/NR2,型,),的辅助激动剂，在动物的大脑中一生都维持着很高的浓度；脑内的神经元和胶质细胞都含有,D-,丝氨酸并且具有特异的生物合成、胞外释放、摄取和降解途径。,D-,丝氨酸作为一种重要的胶质细胞递质，在中枢神经系统参与调节突触可塑性、感觉信息传递、神经发育及神经兴奋性毒性等生理及病理过程,并,逐渐成为阿尔采末病,(AD),等神经系统疾病新的治疗靶点。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,研究背景,如何分离检测,D-,丝氨酸？,针对其外消旋体的拆分已开发了优先结晶法、形成非对映体立体异构体结晶法、酶促法、色谱法（包括：液相色谱、气相色谱、薄层色谱、配位色谱、离子交换色谱）毛细管电泳法和萃取法等。,存在的问题：,丝氨酸,由于其结构简单，分离难度较大，且没有紫外或荧光吸收，常需衍生后才可得到检测。,如何建立,D-Ser,有效检测的快速方法，大大降低检测成本，仍是分析工作者面临的具有挑战性的课题。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,研究背景,高效毛细管电泳（,HPCE,）是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，因具有,低耗、快速、高效、环境友好,等特点而成为新兴的手性分离分析中极具吸引力的分析方法。非接触电导检测是近年来出现的新的检测技术，对于缺乏紫外,-,可见吸收基团氨基酸则,无须先作衍生化,处理,可以进行直接检测。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,研究方案,本课题提出采用高效毛细管电泳,-,非接触式电导法，,以铜,-L-,精氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（,HPMC,）构成二元手性选择体系，,建立快速、灵敏和低成本的,D-,丝氨酸的分离分析新方法。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,分离分析原理,毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间,淌度和分配行为上的差异,而实现高效，快速的新型液相分离分析技术；而非接触式电导检测器是近年发展起来的一种新型电导检测方法。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,实验部分,仪器和试剂,手性选择体系的选择,最佳实验条件的确定,线性范围、重现性、检出限测定,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,仪器,CES2008,型毛细管电泳仪,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,实验试剂,氢氧化钠(NaOH，广州化学试剂厂，分析纯)、柠檬酸(Cit，广州化学试剂厂，分析纯)、乙酸铜(Cu(CH3COO)2H2O，天津市科密欧化学试剂开发中心，分析纯)、羟丙基甲基纤维素(HPMC，山东赫达股份，分析纯)、D,L-丝氨酸、L-丝氨酸(D,L-Ser、L-Ser，国药集团化学试剂，层析纯)、L-精氨酸(L-Arg，上海伯奥生物科技，层析纯)。所用水为超纯水。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,手性选择体系的选择,仅用,Cu(,),丝氨酸对映体未能达到分离,Cu(,)+ L-Arg,分离度,Rs=1.6,Cu(,)-L-Arg,+HPMC,分离度,Rs=2.1,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,手性选择体系的选择,图,1,两种不同的手性选择体系对分离度的影响,Fig. 1 The effect of two different chiral selectors on the resolution,a.Cu(,)-L-Arg b.,Cu(,)-L-Arg-HPMC,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,铜离子浓度对分离度的影响,图,2 Cu(,),浓度对分离度的影响,Fig.2 The effect of Cu(,) concentration on the resolution,本实验选择,Cu(,),的最佳浓度为,2.5mmol/L,。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,L-,精氨酸浓度对分离度的影响,图,3 L-,精氨酸浓度对分离度的影响,Fig.3 The effect of L-Arg concentration on the resolution,本实验选择,L-,精氨酸的最佳浓度为,5.0 mmol/L,。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,HPMC,浓度对分离度的影响,图,4 HPMC,浓度对分离度的影响,Fig.4 The effect of HPMC concentration on the resolution,因此，本实验选择,HPMC,最佳浓度为,10 mg/L,。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,缓冲溶液的组成、浓度及,pH,的影响,NaOH-Cit,体系在非接触电导检测法中有良好的基线和灵敏的响应，但缓冲溶液浓度太高易引起基线漂移。通过实验发现，柠檬酸浓度对对映体分离的影响很大，浓度太低，丝氨酸不出峰；浓度太高，水峰提前，对映体也得不到分离，见,下,表,。,表,1,柠檬酸浓度对分离度的影响,故实验选择,Cit,浓度为,0.4 mmol/L,。,C,Cit,(mmol/L),0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,Resolution(Rs),-,2.3,1.8,-,-,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,缓冲溶液的组成、浓度及,pH,的影响,固定柠檬酸浓度后，加入,NaOH,以调节运行液的,pH,。在,2,4 mmol/L,浓度范围内考察,NaOH,浓度对分离度的影响，见表,2,。,表,2 NaOH,浓度对分离度的影响,故实验选择,NaOH,浓度为,3.0 mmol/L,。,C,NaOH,(mmol/L),2.0,2.4,3.0,3.4,4.0,Resolution(Rs),0.9,1.6,2.4,1.9,1.9,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,缓冲溶液的组成、浓度及,pH,的影响,图,5 pH,对分离度的影响,Fig.5 The effect of pH on the resolution,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,1,电动进样,对离子组分存在进样歧视,2,重力,进样,无进样歧视,3,扩散进样,进样具双向性，有进样歧视,进样方式的选择,故,本,实验,采用重力进样,。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,进样方式的选择,图,6,进样时间对分离度的影响,Fig.6 The effect of injection time on the resolution,进样时间为,60s,时分离度最高，,Rs=2.6。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,进样方式的选择,此外，进样时间还对峰高及峰面积有较大影响，见表,3,。,表,3,进样时间的影响,故实验选择,Cit,浓度为,0.4 mmol/L,。,进样时间（,s,）,30,40,50,60,70,80,100,120,峰,高,L-Ser,49,55,74,84,100,105,139,64,D-Ser,51,68,92,109,122,129,170,82,峰,面,积,L-Ser,1061,1460,2119,2683,2916,2962,4570,1444,D-Ser,1102,1683,2688,3384,3354,3468,5065,1850,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,分离电压的选择,本实验考察了分离电压从,10kV,至,15kV,对丝氨酸对映体分离的影响，见表,4,。,表,4,分离电压对迁移时间和分离度的影响,故实验选择,Cit,浓度为,0.4 mmol/L,。,working voltage (kV),10,12,13,14,15,Resolution(Rs),2.6,2.3,2.0,1.8,1.6,Migrating time of D-Ser(min),48.8,32.7,26.5,23.5,21.8,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,运行液体系：,3.0 mmol/L NaOH+0.4 mmol/L Cit,+2.5 mmol/L Cu(Ac),2,+5.0 mmol/L L-Arg,+10.0 mg/L HPMC,（,pH=9.67,）,重力进样，进样时间为,60s,分离电压为,13kV,最佳实验条件,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,线性范围与检出限,图,7 D-,丝氨酸线性校正曲线图,表,5,线性范围与检出限,待测组分,回归方程,相关系数,线性范围,（,mg/L,）,检出限,（,mg/L,）,D-,丝氨酸,y=-123.8+ 981.9x,r= 0.9999,1,100,0.5,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,重现性测定,在相同条件下，,D-Ser,以,3 mg/L,的浓度重复进样,4,次，,测其重现性，,见表,6,。,表,6,重现性测定,结果表明：,实验证明本方法具有较高的灵敏度和良好的重现性。,序号,1,2,3,4,RSD/%,迁移时间（,min,）,23.1,24.7,22.6,23.3,3.9,峰面积,2400,2473,2616,2680,5.0,实际样品分析,图,8 D-,丝氨酸小鼠脊髓样品,HPCE-C,4,D,谱图,Fig.8 The electropherogram of D-Ser in rat spinal cord,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,拆分机理初步探讨,在缓冲溶液中，铜离子与,L-,精氨酸以,1,2,形成三元络合物：,L-Arg+Cu(,),(L-Arg)Cu,L-Arg+(L-Arg)Cu(,),Cu(L-Arg),2,当丝氨酸对映体进入缓冲系统时，,D-Ser,和,L-Ser,分别取代一分子的,L-Arg,形成两种不同的三元络合物,:,L-Ser+Cu(L-Arg),2,(L-Arg)Cu(L-Ser)+ L-Arg,D-Ser+Cu(L-Arg),2,(L-Arg)Cu(D-Ser)+ L-Arg,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,拆分机理初步探讨,根据,(L-Arg)Cu(L-Ser),和,(L-Arg)Cu(D-Ser),稳定性和光学结构的差异，引起二者电泳淌度的不同，,D,L-Ser,得到分离，本实验中,L-Ser,比,D-Ser,先流出。,由于,(L-Arg)Cu(L-Ser),和,(L-Arg)Cu(D-Ser),的稳定性系数差异不够大，丝氨酸对映体分离度较小。缓冲溶液中加入,HPMC,后，,HPMC,与,Cu(,)-L-Arg,形成二元手性选择体系，,D,L-Ser,分离度提高。,D-,丝氨酸的毛细管电泳,-,非接触式电导分离检测研究,结论,从实验结果可以看出，本实验提出的采用高效毛细管电泳,-,非接触式电导法，,以铜,-L-,精氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素（,HPMC,）构成二元手性选择体系,分离检测,D-,丝氨酸的新方法，,高效简便,、环境友好、成本低、检出限低,，,可用于实际样品的分析应用。,Thank You !,感谢中山大学化学院创新研究基金的资助！,感谢谢天尧老师的悉心指导 ！,感谢袁秋月师姐对本实验给予的耐心的指导和帮助！,报告人：,07,化工 韦昱,