实验10双缩脲法测定蛋白质含量课件

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,*,实验十 双缩脲法测定蛋白质浓度,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,一、实验目的,1,.,学习常见蛋白质含量测定的原理和方法,2.,掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,二、原理,一、分光光度法的基本原理及方法,（一）利用吸收光谱对物质进行定性分析,维生素,B,12,溶液的吸收光谱,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,主要方法：,（,1,）比较吸收光谱曲线,（,2,）比较最大吸收波长,蛋白质的最大吸收波长为,280nm,；,核酸的最大吸收波长为,260nm,。,（,3,）比较吸光度的比值,纯,DNA,：,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,（二）利用吸收光谱对物质进行定量分析,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,1,原理,Beer-Lambert,（比尔）定律：,T=I/I,0,A=lg1/T=lgI,0,/I,A=cl,其中：,T,为透光率；,A,为吸光率；,I,0,为入射光强度；,I,为透射光强度；,为摩尔消光系数；,C,为溶液浓度；,L,为溶液光程的厚度,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,2,常用方法,（,1,）标准曲线法,标准曲线与样品的测定条件必须一致。,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,（,2,）标准管法,C,X,/A,X,=C,S,/A,S,，已知,C,S,，测定,A,S,、,A,X,可求得,C,X,。,（,3,）摩尔吸光系数法,C=A/,（,为,L=1cm,，,C,为,1 mol/L,时的吸光系数，也称为摩尔吸光系数。,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量,被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨，氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，然后再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量,(mol),相当于被测样品中氨的量（,mol,），根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。,因为蛋白质含氮量通常在,16 %,左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数,6.25,，便得到该样品的蛋白质含量。,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,Folin-,酚试剂法,(Lowry,法,),测定蛋白质浓度,蛋白质含有两个以上的肽键,(CONH),，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与,Cu,2+,形成络合物。,Folin,酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进,Folin,试剂,(,磷钼酸,磷钨酸试剂,),，蛋白质,铜络合物能还原磷钼酸,磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏,1020,倍，较双缩脲法灵敏,100,倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。（,Tris,缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸）。,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,紫外分光光度法测定蛋白质浓度,由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在,280 nm,波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值,(OD,280,),与其含量呈正比关系，可用作定量测定。,利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品、可回收利用、低浓度盐类不干扰测定。,含有核酸的样品：,蛋白质浓度,(mg/ml)=1.45A,280,0.74A,260,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,总蛋白定量分析,BCA,（,Bicinchoninic acid,，二辛可宁酸、二羧基二喹啉）,准确灵敏：,BCA,试剂的蛋白质测定范围是,20,2000g/ml,；,Micro BCA,试剂测定范围是,0.5-20g/ml,快速：,45,分钟内完成测定，比经典的,Lowry,法快,4,倍而且更加方便,经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量,不受样品中离子型和非离子型去污剂影响,检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,基本原理：,碱性条件下，蛋白将,Cu,2+,还原为,Cu,+,，,Cu,+,与,BCA,试剂形成紫颜色的络合物，测定其在,562nm,处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度,考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在,595nm,处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比,Lowry,法灵敏,4,倍）。,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,Coomassie Dye-Based,蛋白质定量,PROTEIN,+,A,max,= 595nm,BLUE,Acid,Coomassie G-250,Protein - Dye,Complex,O,CH,2,CH,3,NH,C,CH,3,CH,3,N,CH,2,SO,3,-,CH,3,CH,2,N,CH,2,CH,2,CH,3,SO,3,Na,+,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,双缩脲法测定蛋白质*,双缩脲反应：,双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。本法测定蛋白质范围,1-10mg,H,2,N-CO-NH,2,+ NH,2,-CO-NH,2,H,2,N-CO-NH-CO-NH,2,NH,3,双缩脲,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,三、操作步骤,1.,取,15,支试管，按下表编号、加试剂,2.,各管,混匀,后，加入双缩脲试剂,3.0mL,37,o,C,反应,30min,。,3.,以,0,号管调零,，测定各管,540nm,光吸收值。,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,四、结果处理,1.,绘制标准曲线,以牛血清白蛋白含量为横坐标，,OD,540,为纵坐标，,绘制标准曲线,。,2.,样品的计算,根据样品的,OD,540,从标准曲线上查得样品的蛋白质含量（,mg/mL,），再根据样品的体积算出样品的浓度。,五、注意事项,1.,须于显色后,30min,内测定,，且各管由显色到比色时间应尽可能,一致,。,2.*,样品蛋白质含量应在标准曲线范围内。,3.,比色杯的使用,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,微量表达法,10,-3,(g, m, L) milligram,毫（克）,mg,10,-6,microgram,微（克）,g,10,-9,nanogram,纳（克）,ng,10,-12,picogram,皮 （克）,pg,10,-15,femtogram,飞（克）,fg,10,-18,attogram,阿、渺（克）,ag,10,-24,zepto,（仄普托） 沙（克）,zg,ppm:,parts per million 1,g/ml 1ppm,ppb:,parts per billion 1 ng/ml 1ppb,ppt:,parts per trillion 1 pg/ml 1ppt,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,五、分光光度计的使用,仪器操作键介绍,“方式设定”键（,MODE,）：用于设置测试方式,“,100%T/0ABS”,键：用于自动调整,100.0%T(100.0,透射比,),或,0ABS(,零吸光度,),“0%T”,键：用于自动调整零透射比,“波长设置”旋钮：用于设置分析波长,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,3.,样品测试操作, 打开电源开关，使仪器预热,20,分钟, 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上,打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路, 盖好样品室盖，按“,0%T”,键调透射比零,取出挡光体，盖好样品室盖，按“,100%T”,调,100%,透射比, 按“方式键”（,MODE,）将测试方式设置为吸光度方式,(A),将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中, 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖,将参比溶液推入或拉入光路中，按“,100%T”,调零,A,将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数,实验完成后，关闭电源，,洗净比色皿,，并盖好盖布。,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,返回,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,722,型分光光度计的外形,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,光路,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,光路,实验10双缩脲法测定蛋白质含量,