资料一：核酸分离纯化

核酸分离与纯化,中晶生物,核酸在体内的分部情况：,DNA,真核生物：细胞核：,95,细胞器：,5,RNA,细胞质：,75,细胞核：,10,细胞器：,15,rRNA,：,80-85,，,tRNA,和,mRNA,：,10-15%,概述：,核酸包括,DNA,和,RNA,与,蛋白质结合的状态存在,结构形式多样：,真核生物：染色体,DNA,：双链线性分子,原核生物基因组,DNA,、,质粒、真核细胞器：双链环状,病毒,DNA,：,双链,/,单链环状、双链,/,单链线状,RNA,：,多为单链线性分子,核酸分离纯化的原则：,保持其一级结构的完整性,完整的一级结构是研究核酸功能的最基本要求,遗传信息保存在一级结构中,一级结构决定其高级结构,一级结构决定与其它生物大分子结合的方式,排除其它分子的污染,纯化核酸样品应达到的三点要求：,无有机溶剂和过高浓度金属离子的存在,二者对酶的活性有抑制作用,其它生物大分子的浓度应该尽量低,蛋白质、多糖、脂类：影响后续分子生物学实验,去除其它核酸的污染,尽量减少,DNA,中,RNA,污染，反之亦然,排除异种生物的,DNA/RNA,污染,实验中应注意的几点问题：,减少化学因素对核酸的降解,避免过酸或过碱，操作时,PH,值多在,4-10,之间,减少物理因素对核酸分子结构的破坏,主要是机械剪切力和高温,防止核酸的生物降解,尤其是,RNA,抽提过程中防止,RNase,对,RNA,的降解,尽量减少操作步骤，缩短提取过程,减少各种负面因素对核酸的降解,细胞裂解,有机溶剂的萃取、去除蛋白质及多糖,定量分析,核酸粗制品,凝胶,电泳,柱,吸附法,电,透析法,去除凝胶等杂质,纯的,核酸制品,核酸分离与纯化,DNA,分离,基因组,DNA,分离,质粒,DNA,分离,凝胶,DNA,回收,PCR,产物纯化,核酸抽提与分离,RNA,分离,总,RNA,分离,mRNA,分离,一、基因组,DNA,抽提,过柱离心系列,G-spin Genomic DNA Kit,动物细胞,/,组织，血液，植物,/,食品、细菌,EzWay,Genomic DNA Kit, Multi,动物细胞,/,组织，血液，植物,/,食品、细菌、病毒、酵母,非过柱系列,G-DEX Genomic DNA Extraction Kit,动物细胞,/,组织，血液,Genomic DNA Purification Kit:,动物细胞,/,组织，血液、植物、细菌,G-spin Genomic DNA Kit,分离示意图,分离原理,高盐浓度情况下，硅石与,DNA,结合,低盐浓度情况下，硅石与,DNA,分离,简要流程,结合,洗涤,洗脱,样本,数量（细胞）,DNA,产量,(,ug,),DNA,纯度,SNU1 (Human),3 million,25-35,2.04,SNU601(Human),3 million,25-35,2.0,B16(Mouse),3 million,30-40,2.02,HeLa,Cells,3 million,27-36,2.0,NB4,3 million,23-33,2.01,操作时间：,15-20,分钟,样本,数量（,mg,）,DNA,产量,(,ug,),DNA,纯度,Spleen(Mouse,),20 mg,22-30,2.01,Kidney(Mouse,),30 mg,30-40,2.0,Liver(Mouse,),30 mg,30-40,2.0,细胞,组织,EzWay,Genomic DNA Kit, Multi,原理：,同,G-spin Genomic DNA kit,特点：,试剂无毒性,缺点：,价格相对,IntRON,贵,推荐：,细胞,/,组织、血液、植物,/,食品、细菌,G-spin,系列,酵母,EzWay,系列,病毒,DNA/RNA mix,G-spin,系列,基因组,DNA,抽提常见问题分析,(,一,),Q1,、洗涤后硅胶膜上有杂色残留,细胞裂解不充分,裂解液和样品要充分混匀,Q2,、洗脱产物,DNA,量很少或没有,A,、样品中细胞或病毒浓度低,B,、裂解液和样品混合不均匀造成的细胞裂解不充分,C,、蛋白酶,K,活性下降造成的细胞裂解不充分,D,、温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。,E,、,DNA,洗脱效率低，离心柱中加入洗脱液后室温静置至少,1 min,，再离心,F,、洗脱液,pH,不对，低,pH,值减少,DNA,产率。确保洗脱液,pH,值在,7.0-8.5,之间。,G,、洗脱体积大，超过,200l DNA,浓度会降低，但,DNA,总量不会减少,Q3,、,A260/A280,比值较低,用水作为洗脱液时，比值偏低,Q4,、,A260/A280,比值较高,大量,RNA,残留，没有使用,RNase,A,，或,RNase,A,活性下降,Q5,、,DNA,影响后续酶反应实验,A,、在洗脱液中有残留的漂洗液，可通过再次离心去除,B,、大量,RNA,残留,基因组,DNA,抽提常见问题分析,(,二,),质粒特性介绍：,大肠杆菌染色体,DNA,较质粒,DNA,大得多,染色体,DNA,为线性分子，而大多数质粒,DNA,是共价闭合的环状分子,宿主菌（一般是大肠杆菌株）,DNA,与质粒,DNA,之间的两种主要性质差异：,二、质粒,DNA,抽提,小量抽提,GeneJET,Plasmid,Miniprep,Kit,（有现货）,同下面产品类似，价格相对要贵,DNA-spin Plasmid DNA Extraction Kit,（价格更有优势）,所有后续分子生物学操作，包括转染,EzWay,Plasmid DNA Kit, Mini,（价格太贵）,测序、体外转录与翻译、酶切、转化、文库筛选,中量抽提,DNA-midi Plasmid DNA Extraction Kit,测序、转染、体外转录与翻译,分离示意图,分离原理,高盐浓度情况下，硅石与,DNA,结合,低盐浓度情况下，硅石与,DNA,分离,简要流程,结合,洗涤,洗脱,质粒,DNA,抽提常见问题分析,(,一,),Q1,、未提出质粒或质粒得率较低,A,、大肠杆菌老化：涂布平板，重新挑新菌落,B,、质粒拷贝数低：更换具相同功能的高拷贝载体,C,、菌体中无质粒：有些质粒（,Cosmid,）本身不稳定，多次转接后可能丢失,检查抗生素使用浓度是否正确。,D,、碱裂解不充分：菌液过多，菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液用量。,低拷贝数质粒，加倍使用溶液，有助于增加提取量和质粒质量。,E,、吸附柱过载：不同吸附柱吸附能力不同，如果提取质粒量很大，多次提取。,F,、质粒溶解不充分：洗脱溶解质粒时，加温或延长溶解时间,G,、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位,确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率,H,、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有影响。洗脱体积增大，回收率增高,I,、洗脱时间太短：洗脱时间对回收率有影响。洗脱时放置一分钟可达到较好效果,质粒,DNA,抽提常见问题分析,(,二,),Q2,、质粒纯度不高,A,、混有蛋白：减少菌量。如果混有蛋白悬浮物，再次离心去除,B,、混有,RNA,：,RNase,A,处理不彻底，减少菌量,C,、混有基因组,DNA,：加入溶液后要温和混匀,剧烈振荡会剪碎基因组,DNA,，混杂在质粒中,细菌培养时间过长会导致细胞和,DNA,的降解，不要超过,16,小时。,D,、菌株含大量核酸酶：降解质粒,DNA,，影响质粒,DNA,完整性,选用不含核酸酶的宿主菌，如,DH5,和,Top10,E,、裂解时间过长：请参考说明书推荐流程,F,、质粒二,/,多聚体形式：复制时形成，与宿主菌相关，电泳可检出,三、凝胶,DNA,回收,过柱方法：,MEGA-spin,Agarose,Gel Extraction Kit,(,价格优势，优先推荐,),凝胶,DNA,回收，,100bp-10kb,，,20,分钟，,70-90,MEGAquick,-Spin,PCR&Agarsose,Gel DNA Extraction Kit,凝胶、,PCR,或酶切产物回收，,87bp-20kb,，,20,分钟，效率,95,MEGA-bead,Agarose,Gel DNA Extraction Kit,凝胶,DNA,回收，,87bp-20kb,，,20,分钟，效率,95,EzWay,Gel Extraction Kit,（价格过高）,凝胶回收，,100bp-10kb,，,20,分钟，效率,70-80,非过柱方法：,DNA Extraction Kit,凝胶回收，非过柱，,120bp,，,20,分钟，效率,80,分离示意图,分离原理,高盐浓度情况下，硅石与,DNA,结合,低盐浓度情况下，硅石与,DNA,分离,简要流程,结合,洗涤,洗脱,凝胶,DNA,回收常见问题分析,Q1,、未回收或回收得率较低,A,、胶块未完全溶解：加热水浴，确保胶块完全溶解,B,、胶块太大：切小胶块，分多次回收或者选用大型回收试剂盒,C,、电泳缓冲液,PH,值太高：引起,DNA,无法结合或者结合效率过低，调节到,7.5,以下,高盐及低,PH,结合,DNA,，低盐及高,PH,条件洗脱,D,、洗脱缓冲液不何时：,PH7.0-8.5,的,EB,或水较合适，洗脱效率较高,E,、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位,确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率,Q2,、回收片段无法用于后续实验，如连接,A,、洗涤液残留：洗脱前离心或,50,度烘烤,5,分钟，彻底除去洗涤液,B,、琼脂糖污染，凝胶未全部溶解,C,、洗脱产物中含,ssDNA,：表现为琼脂糖电泳出现小弥散带,95,度加热后退火使单链,DNA,重新退火复性,四、,PCR,产物纯化,过柱方法：,PCRquick,-spin PCR Purification Kit,(,优先推荐,),除去核苷酸、酶、引物、矿物油、盐离子、,EB,、染料、去污剂、,dNTP,/,、过柱、,15,分钟，效率,90%,MEGAquick,-Spin,PCR&Agarsose,Gel DNA Extraction Kit,除去核苷酸、引物等，过柱，,20,分钟，效率,95,EzWay,PCR Clean-Up Kit,(,价格过高,),过柱，,100bp-10kb,，,20,分钟，效率,90-95,非过柱方法：,DNA Extraction Kit,去盐、有机溶剂、核苷酸、引物等，,120bp,，,20,分钟，效率,80,分离示意图,分离原理,高盐浓度情况下，硅石与,DNA,结合,低盐浓度情况下，硅石与,DNA,分离,简要流程,结合,洗涤,洗脱,PCR,产物纯化常见问题分析,Q1,、未回收或回收得率较低,A,、胶块未完全溶解：加热水浴，确保胶块完全溶解,B,、胶块太大：切小胶块，分多次回收或者选用大型回收试剂盒,C,、电泳缓冲液,PH,值太高：引起,DNA,无法结合或者结合效率过低，调节到,7.5,以下,高盐及低,PH,结合,DNA,，低盐及高,PH,条件洗脱,D,、洗脱缓冲液不何时：,PH7.0-8.5,的,EB,或水较合适，洗脱效率较高,E,、洗脱液加入位置不对：加在硅胶膜中心部位,确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜表面达到最大洗脱效率,Q2,、回收片段无法用于后续实验，如连接,A,、洗涤液残留：洗脱前离心或,50,度烘烤,5,分钟，彻底除去洗涤液,B,、琼脂糖污染，凝胶未全部溶解,C,、洗脱产物中含,ssDNA,：表现为琼脂糖电泳出现小弥散带,95,度加热后退火使单链,DNA,重新退火复性,Total RNA,：,Messenger RNA (mRNA),Ribosomal RNA (,rRNA,),Transfer RNA (,tRNA,),五、,RNA,抽提,非过柱方法,最经典的,RNA,抽提方法,TRI Reagent,（,TRIzol,）,（重点推荐，有现货）,过柱方法：,easy-Spin Total RNA Extraction Kit,硅胶吸附原理，,30,分钟，纯度高，无,DNA,残留，动植物细胞,/,组织,RNA-spin Total RNA Extraction Kit,硅胶吸附原理，细胞、组织、细菌，,30,分钟，效率,95,Viral Gene-spin Viral DNA/RNA Extraction Kit,硅胶吸附原理，同时分离病毒的,DNA/RNA,。,20,分钟,MRC,公司简介：,美国公司，全名,Molecular Research Center(MRC),，,专门致力于开发各类,DNA,、,RNA,抽提试剂。,TRI reagent,：,专利产品，唯一商业化的从样本中同时抽提,RNA,、,DNA,和蛋白质的生物试剂。,TRIzol,是,MRC,公司的注册商标。,相关产品：,TRI reagent,：,组织（动物、植物）、单层培养细胞,TRI reagent BD,：,全血、血清,TRI reagent LS,：,细胞悬浮液、其它液体标本,TRI reagent,RNA,抽提操作流程：,组织匀浆（,50mg tissue/ml TRI,）,室温静置,5-10,（细胞裂解过程）,加氯仿（,0.2ml/ml TRI,），,剧烈震荡,15,室温静置,2-3,（氯仿使蛋白变性）,4,度,12000g, 15,取上清，加异丙醇,(0.5ml/ml TRI),，,混匀室温静置,15,4,度,12000g, 10,去上清，,75,乙醇洗沉淀,风干, 15,溶解，保存,RNA,质量检测标准：,测,A,260,/A,280,，,要求,1.80,变性电泳检测（参考条带）,28S,rRNA,（,5kb,）,18S,rRNA,（,2kb,）,5S,tRNA,（,0.10.3 kb,）,补充说明：,原核生物,rRNA,大小应为,23S,和,16S,。,一般情况下，,28S(23S),与,18S(16S),带的亮度高,过柱法分离,RNA,示意图,分离原理,高盐浓度情况下，硅石与,DNA,结合,低盐浓度情况下，硅石与,DNA,分离,简要流程,结合,洗涤,洗脱,RNA,抽提注意事项,RNA,酶非常稳定，抽提时需防止,RNA,酶污染！,尽可能无,RNA,酶环境操作，最好有专门场所,耗材的处理：,电泳槽：,0.5 M,NaOH,处理后,DEPC,水清洗,试管：氯仿浸泡处理后,DEPC,水清洗,枪头和,eppendorf,管：,DEPC,水浸泡后灭菌处理,实验者本身防护：一次性手套，口罩等,启盖前震荡离心管有助于防止气溶胶形成,正确的操作方式,RNA,抽提常见问题分析（一）,Q1,、过柱抽提时柱子堵塞,裂解或匀浆出来不彻底：较少样品用量或增加裂解液用量，增加匀浆和裂解时间,Q2,、得率低,A,、裂解或匀浆出来不彻底：较少样品用量或增加裂解液用量，增加匀浆和裂解时间,B,、,RNA,收集不完全：过柱法：,RNA,未完全洗脱，加入洗脱液后放置几分钟再离心,溶液法：,65,度加热促进,RNA,沉淀溶解,C,、未除尽细胞培养液：收集细胞时需尽量除去培养液,D,、使用,RNAstore,保存的细胞：未有效离心，加大离心力（,3000g,）除去,RNAlater,Q3,、,DNA,污染,匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小,Q4,、蛋白、多糖污染,RNA,沉淀时，加入部分盐溶液，选择性沉淀,RNA,RNA,抽提常见问题分析（二）,Q5,、,A260/A280,比值过低,A,、,匀浆时，样本太多，而抽提液使用量太小（溶液法）,B,、,匀浆后，样本没有放置室温静置,5,分钟（溶液法）,C,、,水相中可能有酚残留（溶液法）,D,、,RNA,沉淀溶解不充分（溶液法）,E,、,RNA,溶解在,DEPC,水而非,TE,溶液中，低离子浓度和,PH,值增加,280nm,吸光值,Q6,、,RNA,降解,A,、取样操作不正确，取样后应立即抽提和冻存,B,、样本保存不当,C,、液相中可能有,RNA,酶污染,D,、制胶时所有甲醛的,PH,值小于,3.5,mRNA,分离原理：,Dynabeads,Oligo(dT),25,是,2.8um,的磁性微球，与,poly(A),配对，,15,分钟就可以完成分离过程。,联系我们,深圳中晶生物技术有限公司,地址：深圳市南山区高新科技园,免费电话：,800 830 6470,Tel: +86 755 86313122,Fax: +86 755 86313266,E-mail:,sales,网址：,