RNA干扰文库及其应用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,RNA,干扰文库及其应用,RNAi,的概况,SiRNA,类型,RNAi,文库（,RNAi,library),RNAi,文库的分类,RNAi,文库的构建策略,RNAi,文库在功能基因组研究中的应用,RNAi,library,技术需要注意的问题,RNAi,概况,RNAi,(RNA interference ，RNA,干扰,)：,短双链,RNA（,dsRNA,）,诱导靶基因,mRNA,特异性降解，或阻止,mRNA,翻译，产生基因沉默（,gene silence),的现象。因此，又称为,knockdown。,1995,年，康乃尔大学,的,Su,Guo,用反,义,RNA,技术抑制,par-1,基因时，意外发现正义,RNA（sense RNA）,也能抑制,C.,elegans,par-1,基因表达。,1998年，,Andrew Fire,和,Craig Mello,揭示正义,RNA,抑制基因表达是由于混有双链,RNA。,RNAi,现象普遍存在动植物体内。发现植物中的21-25,nt,的,RNA,分子诱导,PTGS（post-,transciption,gene silence，,转录后基因沉默）,。,2001,年，,Emily,等在果蝇中确定了降解,dsRNA,的关键酶，并命名为,Dicer，,此酶属于,RNaseIII,家族，在进化上保守。,SiRNA,的类型,寡核苷酸,SiRNA,：,人工合成、体外转录,特点：易于设计、合成昂贵、瞬时表达,吗啡啉核苷,SiRNA,：,人工合成,RNA,类似物。,特点：结合力强，不易降解，效率高,载体表达,型,SiRNA,（,细菌质粒、病毒载体）：基于表达载体在细胞内表达。,特点：稳定表达、可大量扩增，转染效率低，操作繁杂,RNAi,的,机制,细胞自然存在二种干扰,RNA,siRNA,（,短干扰,RNA）：,19-25nt，,由长,dsRNA,裂解而成的小片段，诱导,mRNA,降解。,microRNA,(,miRNA,) ：,22nt，,呈短发夹结构（,short hairpin RNA，,shRNA,），,由,miRNA,前体酶解而成，抑制,mRNA,翻译。,线虫晚期,miRNA,的,形成,早期胚胎发育过程中,miRNA,参与细胞分化,病毒或基因重组,siRNA,的形成及作用,RNAi,的基本过程：,siRNA,形成：,dsRNA,被,Dicer,酶剪切成,siRNA,，,消耗能量；,RISC（RNA-induced silencing complex）,形成：,与,RNAi,辅助蛋白,argonaute,家族分子、,RNA,依赖性聚合酶结合形成,RISC，,消耗,ATP,能量；,RISC,活化：,siRNA,解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式；,阻止翻译或诱导,mRNA,降,解：,在,siRNA,引导下，,RISC,识别并切割互补的,靶,RNA，,无需或消耗少量,ATP。,RNAi,library,人工构建的一系列能对众多基因表达进行干扰的,siRNA,或,shRNA,文库。,RNAi,library,分类,已知基因,RNAi,library,基因家族,RNAi,library,信号通路,RNAi,library,结构域,RNAi,library,全,基因组,RNAi,library,随机序列,RNAi,library,RNAi,library,的,构建策略,三种方案,化学合成,体外转录,体内生物合成（采用,RNA,转录载体）,（一）化学合成,（二）体外转录,体外转录合成,siRNA,以人工合成的寡,DNA,片段为模板,以,cDNA,基因为模板,（,三）体内转录合成,用,RNA,转录载体（质粒、病毒载体）,构建,RNAi,library,通常采用,Pol,III,启动子,U6,或,H1,作为启动子,Pol,III,启动子特点：,总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成,RNA，,遇到45个连续的,U,即终止，非常精确。,（,五）,RNAi,library,的形式,双启动子互补形式,串联形式（,tandem type）,发夹形式（,harpin,type）,siRNA,文库（双启动子互补）,（,四）构建方法,1、,根据靶基因序列，人工合成序列特异,DNA,片段插入到,RNA,表达载体,2、体外合成随机简并,DNA,片段插入到表达载体中,3、,REGS（restriction enzyme generated,siRNA,),方法：,cDNA,片段文库两端接上限制性酶切位点，插入到表达载体中（常采用,BsmB1、BspM1,酶。,4、,miRNA,前体序列替换方法,shRNA,文库（特异,DNA,序列法）,siRNA,文库（随机序列法）,REGS,法,miRNA,前体序列替换方法,发夹结构,SiRNA,的抑制效率比串联结构的,SiRNA,的效率更高,但发夹结构,SiRNA,存在二个严重的问题,一是更难设计发夹结构序列,二是有20-40%的发夹结构在细菌中会发生碱基突变,MIYAGISHI M and TAIRA K,的,研究结果,如何确定作用靶序列,RNAi,的,特点：,SiRNA,的效率取决于,mRNA,序列,随机,SiRNA,只有20-40%有较好的效果,对哺乳动物细胞，最有效的,siRNAs,是21-23个碱基大小、3端有两个突出碱基的双链,RNA；,而对非哺乳动物，比较有效的是长片段,dsRNA,。,多种因素会影响,SiRNA,的效率，,有必要建立靶序列的运算法则,设计原则：,GC,含量在30%50%左右的,siRNA,要比那些,GC,含量偏高的更为有效。,避免在5和3端的非编码区（,untranslated,regions，,UTRs,),设计,siRNA,选用靶基因特异且保守的序列,SiRNA,的特异性取决于靶序列的特异性，与其他同源基因超过3,nt,/21nt,差异，就有较高的特异性。少于1,nt,/21nt,差异，有非特异作用,设计阴性对照,siRNA,RNAi,library,的,应用,基因功能分析,胚胎发育与干细胞基因调控研究,细胞增殖与分化基因调控研究,细胞生长与转移基因调控,多基因疾病发病机制研究,表观遗传学分析（,RNAi,可诱导基因甲基化）,信号通路新分子的筛选与鉴定,寻找新的药物靶标、基因治疗,药物作用机制探讨,应用,RNAi,library,技术需要注意的问题,了解各种,RNAi,library,的优缺点,选择合适的研究对象和目标,建立准确、客观的生物体或细胞形态、结构、功能改变的判别指标，科学评判,RNAi,的作用效率。,建立快速、灵敏、简便的检测方法：形态学、免疫学、生物化学等检测方法；,建立高通量的研究技术平台,