物细胞大规模培养和专用生物反应器

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章 动物细胞大规模培养和专用生物反应器,动物细胞大规模培养技术,所谓动物细胞大规模培养技术,（,large-scale culture technology,）是指在人工条件下（设定,ph,、温度、溶氧等），在细胞生物反应器（,bioreactor,）中高密度大量培养动物细胞用于生产生物制品的技术。,目前,可大规模培养的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、,cho,（中华仓鼠卵巢）细胞、,BHK-21(,仓鼠肾细胞,),、,Vero,细胞,(,非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依赖的成纤维细胞,),等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。,第一节,、常用的培养方法,第二节、动物细胞培养的操作方式,第三节、细胞培养过程的放大,第四节、动物细胞培养生物反应器,动物细胞工程,通常采用的技术手段,动物细胞与组织培养,细胞融合,体细胞克隆,单克隆抗体制备,细胞核移植,人耳鼠,2001,年，一只特别的活老鼠在北京引起轰动,这是有着一对红眼睛的、尾巴长长的、浑身没毛的小白鼠。值得一提的是，这只小白鼠的背上，竟长着一只几乎与身子一般大小的“人耳”。这只老鼠背上的“人耳”是由上海市第九人民医院副院长、整复外科主任曹谊林教授利用组织工程技术复制出来的,。,在京展出的数天，尽管门票高达,20,元，但还是有将近,20,万人，心甘情愿地掏钱一睹“人耳鼠”的风采。,人耳鼠的出现，透露了怎样的信息？,“人耳鼠”再出风头,华南虎是我国特有的,虎,种。华南虎于,1996,年被国际自然保护联盟列为极度濒危的十大物种之一。到目前为止，中国存活的圈养华南虎仅为,70,只，其中包括正在南非野化的,2,只。国内动物园圈养的华南虎只有,68,只，散布在全国,18,家城市动物园中。,除了在恢复华南虎栖息地、生存环境等方面做出积极努力外，我们是否可以借助现代生物技术的力量，帮助华南虎种群数量的恢复？,华南虎,人工关节,软骨再生,1.,第一次手,术,:,从,病人,关节软骨,中未,受力的部分，取出一片,约为,葡萄,干,大小的健康,软,骨,组织,。,2.,分,离软,骨,细胞,并经,三星期的,体,外,培,养,，使,细胞,数,增加,约,10,20,倍。,3.,第二次手,术,:,清理,软,骨受,损,的部分，,从,下方骨,头,部位取出一片,约与伤,口,大,小相同的骨膜，,缝,在,伤,口上方，再,将软,骨,细胞,注射到骨膜下方。,结果,:,经过复健,一年,后,即可,恢复,正常的生活。,在生物技术中，人们已广泛地围绕着细菌、酵母、丝状真菌等微生物的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物。,然而，许多有重要价值的蛋白质等生物物质，必须借助于动物细胞的培养来获得，,例如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，如下页表所示的是一些已实现工业化和正在研究开发的产品。,动物细胞培养的必要性,动物细胞培养的产物,疫苗,人,小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等,动物,牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、鸡痘病疫苗、猪霍乱疫苗、牛疫狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗,单克隆抗体,IgG,、,IgM,、,IgA,等,免疫调节剂,-,细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素、巨噬细胞毒力因子等,酶,尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素,P,、,450,、,纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶、酷氨酸脱羟酶等,激素,绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等,相关过程和关键技术问题,1,、基因工程和细胞工程的发展,2,、大规模动物细胞培养技术和生物反应器的开发。,3,、产品的分离浓缩和提纯技术的提高。,动物细胞体外培养的历史可追溯到,1907,年，美国生物学家,Harrison,在无菌条件下，以淋巴液为培养基成功地在,试管,中培养了蛙胚神经组织达数周，创立了体外组织培养法。,大规模的动物细胞培养开始于上世纪,60,年代，经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进展。尽管如此，目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。,利用动物细胞培养技术生产的生物制品已占世界生物高技术产品市场份额的,50%,。,大量资料表明，生物技术药物是当前新药开发的重要领域，生物技术制药工业是下一个,10,年制药工业的重要新门类，期间将有数百种生物技术新药上市。目前,动物细胞大规模培养技术水平的提高主要集中在,培养规模的进一步扩大,、,优化细胞培养环境,、,改变细胞特性,、,提高产品的产率,与,保证其质量,上。,表 动物细胞培养技术的发展,年份,技术发展概要,1907,年,1951,年,1957,年,1962,年,1967,年,Harrison,创立体外组织培养法。,Earle,等开发了能促进动物细胞体外培养的培养基。,Graff,用灌注培养法创造了悬浮细胞培养史上绝无仅有的,110,10,210,10,cells/L,的记录，标志着现代灌注概念的诞生。,Capstile,成功地大规模悬浮培养小鼠肾细胞,(BHK),，标志着动物细胞大规模培养技术的起步。,Van Wezel,用,DEAE-Sephadex A 50,为载体培养动物细胞获得成功。,年份,技术发展概要,1975,年,1975,年,1986,年,1989,年,Sato,等在培养基中用,激素,代替,血清,使垂体细胞株,GH3,在无,血清,介质中生长获得成功，预示着无,血清,培养技术的诱人前景。,Kobhler,和,Milstein,成功地融合了小鼠,B-,淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定,单克隆抗体的杂交瘤细胞,。,DemoBiotech,公司首次用微囊化技术大规模培养杂交瘤细胞,生产单抗,获得成功。,Konstantinovti,首次提出大规模细胞培养过程中的生理状态控制，更新了传统细胞培养工艺中,优化控制之理论,动物细胞形态,(1),成纤维细胞型,(fibrlblast,或,mechanocyte type),这种细胞形态与体内成纤维细胞形态相似故而得名。细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有圆形核，胞质向外伸出,2,3,个长短不同的突起。细胞群常借原生质突连接成网，生长时呈放射状、漩涡或火焰状走行。除真正的纤维细胞外，凡由中胚层间充质来源的其他组织细胞，如血管内皮、心肌、平滑肌、成骨细胞等，也多呈成纤维细胞形态。,实际上很多所谓成纤维细胞并无产生纤维的能力，只是一种习惯上概括的称法,。,(2),上皮细胞型,(epithilium cell type),这种细胞呈扁平的不规则三角形，中央有圆形核，生长时常彼此紧密连接单层细胞片，起源于外胚层和内胚层组织的细胞，如皮肤表皮及衍生物,(,汗腺、皮脂腺等,),。肠管上皮、肝、胰和肺泡上皮细胞。培养时皆呈上皮型。,(3),游走细胞型,(wondering cell type),这种细胞的培养需要在支持物上生长，一般不连接成片，细胞胞质经常出现伪足或突起，呈活跃的游走和变形运动，速度快而且方向不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其他型细胞相区别，在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能变为成纤维细胞型。,(4),多形性细胞型,(polymorphic cell type),除上述三种细胞外，还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们的稳定形态，可统归多形性细胞。,上述这四种细胞形态均属于贴壁依赖型细胞,，培养这类细胞时，常需贴附在支持物上生长。但由于培养环境的变化，细胞形态常发生改变。,(5),悬浮型细胞,这类细胞常呈圆形，不贴附在支持物上，呈现悬浮状态生长。如血液细胞，淋巴组织细胞及肿瘤细胞。培养这类细胞也可采用微生物培养的方法进行悬浮物培养。,（,a,）成纤维细胞型；（,b,）上皮细胞型；,（,c,）游走细胞型；（,d,）多形性细胞型,图 动物细胞形态,单克隆,抗体,哺乳动物细胞中有一套复杂的,防御系统,保护自己不受,有毒物质,和,病原物,的侵害，其中一部分防御反应就是,淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白,，,这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为,抗原,。,抗体最早是由德国微生物学家,贝林,发现的，它们存在于,人和脊椎动物的血清,之中，是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由于抗体分子具有极其精确的结合特异性，可以识别各种不同的抗原，还可以激活细胞的其他防卫系统以,消灭抗原,，因此抗体在基础研究和临床诊断中获得了广泛的重视和应用。随着,杂交瘤技术、蛋白质工程,和,转基因技术,等技术的发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越广阔的应用前景。,抗体,由,B,细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。,抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在于人或哺乳动物的血清之中。,抗原,如,前所,述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。,对于一个,免疫刺激（,有毒物质或病原物侵入，即抗原,）,，每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是,抗原决定簇,。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为,多克隆抗体,。,有毒物质或病原物侵入，即抗原,指诱导产生抗体的物质。,侵入,抗体,2,抗体,1,多克隆抗体,在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。,单克隆抗体,由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的,单一类型的抗体,。,抗体,动物细胞培养一般步骤,无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净,以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块,将小组织块置解离液离散细胞。解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子,低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养,放入二氧化碳培养箱中培养,动物细胞培养过程示意图,动物细胞培养的过程,动物细胞培养的环境,动物细胞的生长、繁殖和代谢等生理性质在很大程度上受到各种环境因素的影响。为了使动物细胞的培养处于最佳状态，了解环境因素对其影响无疑是很重要的，影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有温度、,PH,值、营养成分、溶氧、气体环境、渗透压以及其他因素。,温 度,细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度是不尽相同的，例如,昆虫细胞的最适温度是,25-28,，,人和哺乳动物的细胞的最适温度是,37,.,细胞代谢强度与温度成正比，高于最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。总的来说，,动物细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强,，如温度升至,45,时，,1h,内人和哺乳动物细胞将被杀死；相反，降低细胞置于,25-35,时，细胞仍能生长，但速度减慢，并维持长时间不死，甚至于放在,4,，数小时后再置于,37,培养，细胞仍能继续生长。,PH,值,合适的,PH,值是细胞生存的必要的条件之一。动物细胞合适的,PH,值一般在,7.2-7.4,，低于,6.8,或高于,7.6,时都对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞退变或死亡。不同的细胞对,PH,值也有不同的要求，原代培养细胞对,PH,值的变化耐受性差，传代细胞对,PH,值变化的耐受性较强。而对于同一种细胞，增长期和维持期的最适,PH,也不尽相同，对于大多数细胞来说，偏碱性环境比酸性环境更有利于细胞的生长。,营养成分,细胞的生长、繁殖以及产物的合成都必须从环境中摄取各种营养物质，以合成细胞物质及在新陈代谢中起调节作用。这些营养物质包括碳源、氮源、氨基酸、无机盐、微量元素、生长因子等。,溶氧及气体环境,渗透压等其它因素,其它环境条件,培养器皿,动物细胞培养瓶内表面为什么要光滑、无毒？,在培养过程中，如何才能保持无菌与无毒的环境？,培养基的组成,培养基,是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养最重要的条件。,用于动物细胞的培养基可以分为,天然培养基和合成培养基两 大类。,天然培养基,是使用最早、最为有效的动物细胞培养基，它主要取自于动物体液或从动物组织分离提取而得，,其优点是,营养成分丰富、培养效果良好；,缺点是,成分复杂、个体差异大、来源有限。,天然培养基的,种类,有很多，包括生物性液体（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如血浆）等。,血液组成：红细胞、白细胞、血小板和血浆。,高速离心，分三层：上层为血浆,-40,%,多。,血浆冷冻到,-30,度，离心，分层：上层为血清，下层为杂蛋白（少）。,血清,组织细胞培养中最常用的天然培养基是血清，这是因为血清中含有包括大分子的蛋白质和核酸等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖、粘附及中和某些物质的毒性起着一定的作用。用于组织细胞培养的血清的种类很多，其来源主要是动物，有小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清以及人血清等，最广泛使用的是小牛血清和胎牛血清。优质的血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。,血浆,组织浸出,液,血浆不仅可用来支持培养组织块，而且还供给细胞生长营养物质，但由于血浆很容易发生传染，目前已很少单独使用。一般使用的是禽类血浆。,组织浸出液常用的是胚胎浸出液（如鸡胚浸出液），它的主要成分含有大分子核蛋白和小分子的氨基酸，有促进细胞生长的作用。,水解乳蛋白,水解乳蛋白是常用的一种天然培养基，是由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。一般配制成,0.5%,的溶液，或与合成培养基以,1,：,1,共同使用。,合成培养基,是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。,这种培养基在很多方面有天然培养基所无法比拟的优点，它,既能,给细胞提供一个近似于体内的生存环境，,又便于,控制和提供标准化体外生存环境。,目前所有的细胞培养都已采用经标准化生产、组成和含量都相对固定的各种合成培养基,，并已有配制好的干粉型商品。尽管现在的合成培养基成分和含量已经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要，合成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以补充。,合成培养基,常用的合成培养基,目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基都是为适应某种组织细胞的生长而在某种合成培养基的基础上改良而来的。目前较为常用的有,199,培养液、,Eagle (MEM,、,DMEM,),培养液、,RPMI1640,培养液、,HAM,培养液等。基础培养基的产品配方成分是公开的，并被业界普遍采纳和使用。例如,:MEM,、,DMEM,、,1640,、,199,、,PRMI1640,、,IMDM,、,F12,等细胞培养基。,个性化培养基在国外生物制药企业被普遍采用。不同的生物制品，不同的细胞株，不同的生产工艺，都需要与之对应的个性化细胞培养基来支持。,个性化细胞培养基,被国际生物制药公司普遍采用,动物细胞培养方法,所谓,动物细胞培养,是将动物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。,性质,微生物细胞,动物细胞,大小,1-10m,10-100m,代谢调节方式,内部,内部和激素,营养要求,宽松，可利用多种底物,苛刻,生长速率,倍增时间一般为,0.5-2h,倍增时间一般为,12-60h,机械强度,较好,很差，缺乏保护性细胞壁,环境适应,好,差,微生物细胞和动物细胞性质的比较,微生物和动物细胞培养方法的比较,微生物细胞,动物细胞,PH,控制,添加酸、碱,CO,2,-HCO,3,缓冲液,搅拌速度,速度快、范围广,较慢,溶氧控制,改变搅拌速度、通气量、进气氧浓度,改变进入气体的氧浓度,培养基灭菌方法,高温蒸煮,过滤,培养时间,几小时,几天,几天,3,、,4,周,对水纯度的要求,较低,很高,与,微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：,一类是非贴壁依赖性细胞,，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；,另一类是贴壁依赖性细胞,，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。,第一节 常用的培养方法,体外培养的动物细胞有两种类型,一种是非贴壁依赖型细胞,，来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）和某些转化细胞属于这一类型，可采用类似微生物培养的方法进行悬浮培养。,另一种是贴壁依赖型细胞,，大多数动物细胞，包括非淋巴组织的细胞和许多异倍体细胞属于这一类型，他们需要附着于带适量正电荷的固体或半固体表面上生长。,在贴壁培养过程中，贴壁依赖性细胞需要附着,在带适量正电荷或半固体的表面上,，原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展开来，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般可在数天后铺满生长表面，形成致密的细胞单层。,一、贴壁培养,细胞贴壁一般分为：,贴壁因子吸附于培养表面,、,细胞与表面接触,、,细胞贴壁于培养表面,和,贴壁细胞在培养表面上扩展,等几个步骤。,大多数动物细胞属于贴壁依赖型细胞,常用的细胞系,Hela,：美国妇女宫颈癌细胞,Vero,：非洲绿猴肾细胞,BHK,：仓鼠肾细胞,CHO,：中国仓鼠卵巢细胞,细胞贴壁过程,细胞接触抑制,接触抑制,(contact inhibition),细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。,肿瘤组织或细胞 正常组织或细胞,动物细胞或组织培养的难易程度,幼体组织或细胞 老龄组织或细胞,分化程度低的组织或细胞 分化程度高的组织或细胞,原代培养：,传代培养：,从供体获取组织或细胞后的初次培养，一般把,第,1,代,细胞的培养与传,10,代以内,的细胞培养统称为原代培养。,将原代培养的细胞分离稀释后转入到新的培养基中继续培养，称为传代培养。一般是,10,代以后传到,40,、,50,代,。,1,、,传代培养的细胞都能一直传代下去吗？,2,、有些细胞为何能一直传代下去？,问题,取,的组织、器官,细胞悬浮液,酶,10,代细胞,培养,40-50,代细胞,培养,细胞株,无限传代,细胞系,单个细胞,加,液,遗传物质,未,改变,遗传物质,已,改变,动物胚胎 或幼龄动物,胰蛋白,培养,原代,传代,微载体系统的优点,1,、表面积,/,体积比大。,2,、微载体悬浮于培养基中，细胞生长环境均一，简化了这些环境因素的检测和控制。用简单显微镜能观察细胞生长情况。,3,、培养基利用率高。,4,、采样重演性好。,5,、收获过程不复杂。,6,、放大较容易。,7,、劳动强度小，占用空间小。,影响微载体培养的特殊因素,微载体浓度,接种浓度,搅拌转速,二、悬浮培养,所谓悬浮培养,，是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程。主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤细胞等。,动物细胞的悬浮培养,是在微生物发酵的基础上发展起来的。由于动物细胞的特点（如：没有细胞壁保护，不能耐受剧烈的搅拌和通气），因此在许多方面又与经典的发酵不同。,悬浮培养,的细胞密度较低，转化细胞悬浮培养有潜在的致癌危险，培养病毒易失去病毒标记而降低免疫能力。,三、固定化培养,固定化培养,是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有,细胞生长密度高,、,抗剪切力,和,抗污染能力强,等,优点,。,由于所培养的细胞的不同，固定化,培养的方式,也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用,胶原包埋,，而对于非贴壁依赖性细胞则常用,海藻酸钙,包埋。,常用的细胞固定化的方法有,1,、吸附,：选择适当的条件，将细胞和支持物混合，细胞便贴附在支持物的表面。,2,、共价贴附,：细胞和支持物通过化学键结合，减少了细胞泄露。,3,、离子,/,共价交联：,如果用聚合物（聚氨等）处理细胞悬液，则会在细胞之间形成桥使之絮结。,4,、包埋：,此法步骤简单，条件温和，细胞和高聚物或单体混合，随着凝胶的形成，细胞嵌入到高聚物网络中。,5,、微囊化：,是在液体状态和生理条件下制备的。对细胞的生长条件改变不大。,特点,吸附,共价贴附,离子,/,共价交联,包埋,微囊,负载能力,机械保护,细胞活性,制备,扩散限制,细胞泄露,低,无,高,简单,无,有,低,无,低,复杂,无,无,高,有,高,简单,有,无,高,有,低,简单,有,无,高,有,高,复杂,有,无,表,2-1,动物细胞固定化各种方法的特点,第二节 动物细胞培养的操作方式,动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养，均可分为,分批式、流加式、半连续式、连续式、灌注式,等多种培养方式。,一、分批式培养,分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。,在细胞分批培养过程中，,不向培养系统补加营养物质，而只向培养基通入氧，能够控制的参数只有,PH,、,温度和通气量，,因此细胞所处的生长环境随着营养物的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化，不能使细胞自始至终处于最优的条件下，因而分批培养并不是一种很好的培养方式。分批培养过程的持征如图所示。,0,时间,分批,分批式培养过程的特征,营养物,废,产物,PH,、,温度、,DO,0,培养时间（,d,）,细胞密度,对数生长期,减速期,平稳期,衰退期,延,滞期,分批式培养的生长曲线,在分批式培养过程中，细胞的生长可分为,延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。,为什么说采用分批式培养细胞效果不佳？,分批式培养,二、流加式培养（,补料分批式,）,流加式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中,随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分,，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。,流加式培养只是向培养系统补加必要的营养成分，以维持营养物质的浓度不变。由于流加式培养能控制更多的环境参数，使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态。,流加式培养有何特点？,0,时间,流加,流加式培养过程的特征,PH,、,温度、,DO,废,产物,营养物,流加操作的特点就是能够调节培养环境中营养物质的浓度。,一方面,，它可以避免某种营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制现象。,另外一个方面,，能防止某些限制性营养成分在培养过程中被消耗而影响细胞的生长和产物的形成，这是流加式操作与分批式操作的明显不同。此外，由于新鲜培养液的加入，,整个过程中反应体积是变化的,，这也是它的一个重要特征。,最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。,根据流加控制方式不同，有两种流加式培养方式,：,无反馈控制流加,和,有反馈控制流加,。,无反馈控制流加,包括,定流量加,和,间断流加,等；,有反馈控制流加,一般是连续或间断地测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标来调节流加速率或流加液中营养物质的浓度等。,流加控制方式,三、半连续式培养,半连续式培养又可称为,反复分批式培养或换液培养,，是指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。,四、连续操作,连续式操作,是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜的培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。,与分批式操作和半连续式操作不同,。连续培养可以控制细胞所处的环境条件长时间的稳定，因此，可以使细胞维持在优化状态下，促进细胞生长和产物形成。,五、灌注式操作培养,灌注式操作,是指细胞接种后进行培养，一方面新鲜培养基不断加入反应器，另一方面又将反应液连续不断地取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。,细胞灌注培养系统实例,新鲜培养基,收液,过滤器,液位,控制,细,胞,悬,液,细,胞,细胞培养系统,动物细胞的连续培养一般是采用灌注培养。灌注培养是把细胞接种后进行培养，一方面连续向反应器中注入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中,不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态,。当高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞以足够的营养以及除去有素毒的代谢物。灌注培养时用新鲜的培养液进行灌注，可以确保上述目的的实现。通过调节灌注速度，可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下。灌注培养过程的特征如图所示。,采用灌注培养的优越性,不仅在于大大提高了细胞生长密度，而且有助于产物的表达和纯化。因此，灌注培养已经应用于许多不同的培养系统中，规模已达几百升。,灌注培养的特点,0,时间,灌注,PH,、,温度、,DO,废,产物,营养物,灌注培养过程的特征,不同培养方式对,CHO,细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂（,tPA,),产量和活性的影响,细胞培养方式,分批培养,半,连续培养,灌注培养,纯化,利率 ，,%,8,21,65,纯化物质的相对产量,1,1.33,7.74,比,活性，,IU/,mgtPA,114.4,391.3,392.6,第三节 细胞培养过程的放大,放大,通常是指生产规模的增大和生产能力的增加。,放大的目的,是更大规格重现某个过程并实现预期的实验结果。,5,个不同阶段,（,动物细胞培养由实验室建立的细胞株到反应器的大规模培养,）,第一阶段，,筛选和开发能表达所需产物的细胞系。,第二阶段，,在方瓶和转瓶中确定该细胞系对营养物质和环境的要求。,第三阶段，,细胞培养转入生物反应器中进行，最理想的是采用由生产规模的反应器缩小的台式反应器。,第四阶段，,在中试规模进一步根据生产的实际条件和可能性，确定过程的控制方案，根据细胞株的实际情况寻求过程的优化方案，对培养的环境作进一步的调整。,第五阶段，,扩大到生产规模。,细胞培养放大过程的,5,个主要阶段,步骤,装备,培养规模,筛选细胞系,确定培养条件,产物表达的优化,为放大修正条件,放大生产,细胞,/,组织培养实验室,细胞,/,组织培养实验室,生物工程实验室，细胞培养实验室,实验室，中试车间,生产车间，中试车间,96,孔板，方瓶,方瓶、滚瓶、转瓶,台式生物反应器,台式和中试生物反应器,生产用和中试反应器,放大过程中的主要影响因素,一、培养基组成,二、限制细胞生长的因素,三、污染的控制,四、产物表达的控制,五、硬件和过程设计参数,六、产物收获,一、培养基组成,血清的作用在于向细胞提供激素（生化因子）、转移蛋白和其他营养物质。目前血清是培养基中不可缺少的组分，并成为达到最优化和经济性目标的障碍。降低血清用量和采用无血清培养基成为研究的热点。,血清培养基的考虑,1,、血清中含有广泛的微量组分，对细胞生长有相当大的作用，但对其存在的作用至今还未充分确定。,2,、对通过细胞培养获得产物的过程，血清的存在是纯化的主要障碍，甚至难以使产物形成医药产品。,3,、血清常受病毒污染，其中许多对细胞培养无害，但增加了未知因素，未操作者不能控制。,4,、血清是培养基成本的主要部分,5,、血清不仅有生长促进活力，而且有生长抑制活力。,6,、实验和生产过程的标准化困难。,二、限制细胞生长的因素,在动物细胞培养系统中有许多因素限制了细胞生长。与微生物发酵相比，动物细胞培养能达到的细胞密度比较低。根据不同的细胞类型、培养系统和培养基组成，其范围为每毫升（,0.5-5,）,10,6,个细胞。,三、污染的控制,动物细胞培养物可能被各种微生物病毒污染。这些污染物的来源包括细胞种子、血清、试剂、实验室环境和操作人员。,在生产过程或实验室空间中，完全没有微生物的污染是不可能的，这需要通过改进设备的设计消除这些污染源，其中反应器的设计是关键。实验人员也常是重要的污染源，无菌操作技术的良好训练是污染控制的基础,。,四、产物表达的控制,动物细胞培养的产物有两大类。一是细胞本身，另一是由细胞分泌的某些产物。由细胞分泌的产物可以分为,3,类：,1,、天然产物,，如淋巴因子、激素、病毒等。,2,、基因工程产物,，如病毒亚单位蛋白。,3,、融合细胞产物,，如单克隆抗体。,产物表达的最优化条件,细胞生长的最优化条件并不一定是产物表达的最优化条件。产物常常在细胞的衰退期得到最佳表达，而不是在对数生长期。目前在稳定期或衰退期控制基因表达仍很困难。,产物表达的问题主要是生物学方面的，这些问题的生物学解决办法有：,1,、建立能更高密度生长或对生长条件要求不太严格的,细胞系,。,2,、开发能大量生产目标产品的,细胞系,。,3,、有可能通过诱导分裂或诱导存在质粒的表达使细胞具有,高水平的产物表达,。,4,、开发更好的,克隆载体,。,五、硬件和过程设计参数,与大规模动物细胞培养有关的反应器和设备问题可归纳为：,1,、细胞培养环境的控制,（温度、溶解氧、二氧化碳、,pH,值、渗透压）,2,、污染的排除,（阀门设计、流体转移系统、培养基灭菌）,3,、抑制潜在的生物病毒物的扩散,（反应器的取样，产物的收获）,4,、为贴壁生长细胞提供足够的表面积,（固体介质的性质、培养系统的比表面积）,5,、在培养中对剪切力的控制,（搅拌、通气、细胞收获）,六、产物收获,得到大量的细胞所需解决的问题包括：,1,、开发细胞培养方法和工艺，提高细胞密度，使收获细胞容易。特别是贴壁生长的细胞。,2,、冻存好细胞，确保细胞种子的重复性。,与蛋白质收获有关的问题包括：,1,、在生长培养基中存在污染产物的血清蛋白质。,2,、由培养细胞表达的细胞产物浓度很低。,3,、在培养条件下产物的不稳定性。,解决蛋白质纯化的方法包括：,1,、使用无血清（甚至无蛋白）培养基使“污染”蛋白量最少。,2,、开发产物特异的亲和柱。,3,、开发筛选技术以快速地确定产生大量产物的细胞克隆。,4,、开发在无血清培养基中稳定蛋白质产物以及抑制细胞内、外蛋白酶活性的方法。,5,、采用中空纤维、微囊或其他合适的技术分离或浓缩产物。,纯化的步骤不仅要求效率高，而且尽量不在产物中加入不需要的组分。,第四节 动物细胞培养生物反应器,生物反应器的设计需满足的要求,1,、生物因素：生物相容性，模拟细胞在体内的生长环境。,2,、化学因素：必须提供足够的停留时间，完成所需要的转化率，符合过程反应动力学的要求。,3,、传质因素：满足物质传递的要求。,4,、传热因素：有能力除去和加入反应过程的热量。,5,、安全因素：有毒害的反应物和产物的隔离，有优良的防污染性能。,6,、操作因素：便于操作和维修。,动物细胞培养生物反应器,自,20,世纪，,70,年代以来，用于动物细胞培养的生长反应器有了很大的发展，种类越来越多，规模也越来越大。根据,生物反应器的不同用途,，有,悬浮培养用、贴壁培养用、包埋培养用生物反应器,等，其,种类大致上有,塑料增殖器、,填充床增殖器,、多层板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶质矩形通道蜂窝状增殖器、,流化床反应器,、,中空纤维,及其他膜式反应器、桨式搅拌反应器、棒式搅拌反应器、船舶推进桨反应器、倾斜桨叶搅拌反应器、般帆形搅拌反应器、往复振动锥孔筛板搅拌反应器、,笼式通气搅拌反应器,、,双层笼式通气搅拌反应器,、,空气提升式反应器,等。,一、生物反应器的种类,1,、悬浮培养用,有空气提升式（如英国,Celltech,公司和瑞士,Chemap,公司）、搅拌槽（如美国,NBS,公司和德国,GBF,）、中空纤维管（如美国,Bioresponse,和,Invitron,公司）及陶质矩形通道蜂窝状生物反应器。,2,、贴壁培养用,有搅拌槽（微载体系统）、中空纤维管和陶质矩形通道蜂窝状生物反应器。,3,、包埋培养用,有流化床（如美国,Bellco,公司）、固定床生物反应器。,二、气升式细胞培养生物反应器,气升式反应器的基本原理如图所示。气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管使得中央导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。,气升式生物反应器主要采用内循环式,，但也有采用外循环式。,气升式生物反应器,与搅拌式生长反应器相比，气升式生物反应器产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量大，能使细胞和营养成分均匀地分布于培养基中。,气升式生物反应器特点,气升式反应器和传统培养方法的抗体产率比较,细胞系,抗体类型,抗体产量，,mm/l,气升式,/,传统,培养瓶,滚瓶,气升式,1,IgG,14,20,86,5.1,2,IgM,70,127,295,3.0,3,IgG,9,10,73,7.7,4,IgG,28,30,100,3.4,5,IgG,60,76,260,3.8,6,IgM,20,25,112,5.0,7,IgG,30,38,200,5.9,8,IgG,120,100,350,3.2,在气升式生物反应器中，,溶氧的控制,可以通过自动调节进入空气的速率来实现；,PH,值,可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠来控制。,八种细胞的有关培养数据，可以看出同传统的方法（,培养瓶和滚瓶,）相比，气升反应器的抗体产量,平均提高,4.6,倍,。,三、中空纤维管生物反应器,中空纤维管生物反应器如下页图所示，它的,用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度最高可达,10,9,/ml,数量级。如果控制系统不受污染，能长期运转,。已用这种反应器培养过的细胞型和生产的分泌产物如表所示（,P44,，表,2-6,）。,中空纤维反应器示意图,生长的细胞型,杂交瘤细胞、淋巴细胞、肝癌细胞、结肠癌细胞、胚胎细胞、乳腺组织细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、成纤维细胞、垂体肿瘤细胞、,CHO,细胞、,BHK-2,细胞、肺细胞等,分泌的产物,IgG,、,IgM,、,IgA,、,干扰素、激素、尿激酶、蛋白质,C,、,病毒蛋白、乙型肝炎表面抗原、,T,抑制因子、促细胞生长素、白细胞介素等,细胞,培养基入口,培养基出口,空气与,CO,2,出口,空气与,CO,2,入口,中空纤维管生物反应器已进入工业生产，,主要用于,培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。,中空纤维式生物反应器,平床式,中空纤维式生物反应器,四、通气搅拌生物反应器,CelliGen,笼式通气搅拌器,搅拌式生物反应器,Celligen,plus,Celligen,310,Celligen,系列生物反应器工作原理,CellGen,plus,生物反应器,五、无泡搅拌反应器,无泡搅拌反应器是一种装有膜搅拌器的生物反应器。它采用多孔的疏水性塑料管装配成通气搅拌浆，具有良好的氧通透性，同时解决了通气和均相化的要求。这类反应器能提供动物细胞生长中所需的氧，产生的剪切力较小，在通气中不产生泡沫，已广泛应用于实验室研究和中试、工业生产。,六、动物细胞反应器的控制,1,、溶氧值：,可通过改变通入培养罐内气体中的氧气和氮气的比例。,2,、,PH,的调节：,可采用二氧化碳,/,碳酸氢钠缓冲液系统。,3,、温度和搅拌转速的控制。,其它：流化床生物反应器,流化床生物反应器的基本原理类似于流态床化学反应器，不同的是，流态化的固体是带有,细胞,的微粒。培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在微粒中生长；同时，不断地加入新鲜的培养液，并不断地排除培养产物或代谢产物。,下页图为生产用,CF-IMMOTM,流化床生物反应器的示意图,，这种反应器的传质性能很好，并在循环系统中采用,膜气体交换器,，能快速提供给高密度细胞所需的氧，同时排除代谢产物；反应器中的液体流速足以使细胞微粒悬浮却不会损坏脆弱的细胞。由于流化床生物反应器满足了高密度细胞培养、使高产量细胞长时间停留在反应器中、优化细胞生长与产物合成的环境等细胞培养的要求，流化床生物反应器既可用于贴壁依赖性细胞的培养，又可用于非贴壁依赖性细胞的培养。,气体交换,氧气,回流,收获,营养液,泵,反应塔,加热器,PH,传感器,T,DO,CO,2,生产用,CF-IMMO,TM,流化床生物反应器示意图,流化床生物反应器与其它方法培养达到的细胞比较,培养类型,细胞类型,细胞密度（个,/ml,）,流化床,杂交瘤,0.3*10,8,贴壁依赖性细胞,1.3*10,8,恒化器,杂交瘤,2*10,6,微,载体搅拌釜,贴壁,依赖性细胞,0.2*10,7,-2*10,7,固定床或流化床式生物反应器,透析袋或膜式生物反应器,动物细胞大规模培养工艺,大规模动物细胞培养的工艺流程如下页图所示。工艺过程中，先将,组织切成碎片,，然后,用溶解蛋白质的酶处理,而得到单个细胞，再用,离心法,收集细胞。将,细胞植入营养培养基,，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再,接种到若干培养瓶中进行扩大培养,，将培养所得的细胞,“,种子,”,冷藏于液氮中,，从液氮中取出一部分细胞,“,种子,”,进行解冻、复活培养,，进行,扩大培养,以获得足够的细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行,大规模培养,，按照产物的不同形式进行,产物分离纯化,。对于积累在细胞内的产物，可通过收集细胞后进行破胞，再经过分离纯化获得产物；对于由细胞分泌到培养液中产物，可以通过浓缩、纯化培养液来获得产品；而对于那些,必须加入诱导剂进行培养或病毒感染培养,才能得到的产物的细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，收集细胞，再经分离纯化得到产物。,大规模动物细胞培养工艺流程图,细胞培养反应器,提取,细胞,诱生剂,细胞,产品（肿瘤抗原）,纯化,产品（干扰素）,纯化,提取,产品（单克隆抗体）,浓缩纯化,7,9,8,6,5,4,3,2,1,10,2,、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是 （ ）,A,细胞系,B,细胞株,C,原代细胞,D,传代细胞,1,、动物细胞工程技术的基础是 （ ）,A.,动物细胞融合,B.,单克隆抗体,C.,胚胎移植,D.,动物细胞培养,A,D,练习题,3,、用于动物细胞培养的组织和细胞大都取自胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织，其主要原因是这样的组织细胞 （ ）,A,、容易产生各种变异,B,、具有更强的全能性,C,、取材十分方便,D,、分裂增殖的能力强,D,4,、在动物细胞培养的有关叙述中正确的是：（ ）,A,、,动物细胞培养的目的只是为了获得大量的细胞分泌蛋白,B,、,动物细胞培养前要用胰蛋白酶使细胞分散,C,、,细胞的癌变发生在原代培养向传代培养的过渡过程中,D,、,培养至,50,代后传代细胞称为细胞株,B,5,、一般说来，动物细胞体外培养需要满足以下条件（ ）,无毒的环境 无菌的环境 合成培养基需要加入血清 温度与动物体温相似 需要,O,2,，不需要,CO,2,CO,2,能调节培养液,PH,A,、,B,、,C,、,D,、,D,6,、动物细胞培养的特点 （ ）,细胞贴壁 有丝分裂 分散生长 接触抑制 减数分裂 原代培养一般传,1,10,代,A,、,B,、,C,、,D,、,A,7,、下图是动物细胞培养的基本过程示意图。请据此回答：,（,1,）容器,A,中放置的是动物器官或组织。它一般取自,_,。,（,2,）容器,A,中的动物器官或组织首先要进行的处理是,，然后用,酶处理，这是为了使细胞分散开来，这样做的目的是,。,（,3,）培养首先在,B,瓶中进行，瓶中的培养基成分有,_,_,等。在此瓶中培养一段时间后，有许多细胞衰老死亡，这是培养到第,代，到这时的培养称为,_,。,（,4,）为了把,B,瓶中的细胞分装到,C,瓶中，用,处理，然后配置成,，再分装。,（,5,）在,C,瓶中正常培养了一段时间后，发现细胞全部死亡，原因是,。,作业题,1,、动物细胞常用的培养方法有哪些？试分别说明。,2,、动物细胞培养的常用操作方式有哪些？试分别说明。,3,、降低血清用量或采用无血清培养基的原理？,4,、动物细胞培养生物反应器设计必须满足的要求。,5,、动物细胞常见的生物反应器有哪些种类？试讲述常用生物反应器的特点。,