质粒提取和酶切分析

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,质粒提取和酶切分析,中心实验室,质粒,DNA,的限制性内切酶酶切分析,1.,实验目的,学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法 ，并理解限制性内切酶是,DNA,重组技术的关键工具。,感受态细胞转化效率转化子总数感受态细胞总数,2.,相关基础知识,限制性核酸内切酶：是一类能识别双链,DNA,分子特异性核酸序列的,DNA,水解酶。它是基因工程中用于体外剪切基因片段的重要工具酶。,上世纪七十年代，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制,-,修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的,Eco,R,I,和,Eco,R,II,，以及来源于流感嗜血杆菌,(,Heamophilus,influenzae,),的,Hind II,和,Hind III,。这些酶可在特定位点切开,DNA,，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能及表达非常有用的工具。,1),寄主控制的限制与修饰现象,限制与修饰系统是,细菌细胞的一种防卫手段。各种细菌都能合成一种或几种能够切割,DNA双链的核酸内切酶，,它们以此来限制外源,DNA存在于自身细胞内，但合成,这种酶的细胞自身的,DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶，对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用。,这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。,2),限制性核酸内切酶的类型及特性,按限制酶的,亚基组成和,切断核酸情况,的不同，分为三类,：,型,型*,型,第一类（,I,型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割,DNA,链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在,DNA,重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析,DNA,结构或克隆基因。这类酶如,Eco,B,、,Eco,K,等。,第三类（,III,型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度,DNA,片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。,第二类,(II,型,),限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是,DNA,重组技术中最常用的工具酶之一。,这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是,4,个或,6,个核苷酸，少数也有识别,5,个核苷酸以及,7,个、,8,个、,9,个、,10,个和,11,个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：,粘性末端,；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。,如,Eco,RI,的识别顺序为：,5 G,|,AATTC 3,3 CTTAA,|,G 5,在双链上交错切割的位置切割后生成,5G AATTC3,3CTTAA G5,各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过,DNA,连接酶的作用而“粘合”。,II,型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如,Eco,RV,的识别位置是：,5 GAT,|,ATC 3,3 CTA,|,TAG 5,切割后形成,5 GAT ATC 3,3 CTA TAG 5,这种末端同样可以通过,DNA,连接酶连接起来。,平头末端：,异源同工酶：,又称同裂酶,有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为,同裂酶（或同切酶）,。,同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如,Hpa,和,Msp,的识别顺序都是,5G,|,CG G3,3G GC,|,G5,3,） 同裂酶和同尾酶：,有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为,同尾酶,同尾酶的切割产物可以通过,DNA,连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。,同尾酶：,如,Xba,1,和,Nhe,1:,5T,|,CTAGA3 5,G,|,CTAGC,3,3AGATC,|,T5 3,CGATC,|,G,5,5T,CTAGA3 5,G CTAGC,3,3AGATC,T5 3,CGATC G,5,5T,CTAGC,3,3AGATC,G,5,这些粘性末端连接后，,Xba,1,和,Nhe,1,酶将不能再切割，但可以利用,Bfa,1(,酶切识别位点为,GATC),来进行再切割。,4),限制性核酸内切酶的命名法,用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如,E. coli,用,Eco,表示，所以用斜体字。,用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌,(,Heamophilus,influenzae,)Rd,菌株用,d,，即,Hin,d,。,如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰酶，则以罗马数字表示，如,Hin,d,Hin,d,，,Hin,d,等。,3.,酶切反应的设计一般应注意问题,:,大多数限制酶贮存在,50,甘油溶液中，以避免在,-20,条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于,12,时，某些限制酶的识别特异性降低，从而抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的,10%,。,反应混合物中基因组,DNA,底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的基因组,DNA,会形成粘性,DNA,溶液,从而抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的基因组,DNA,浓度为,0.1-0.4ug/ul,。同时,RNA,应该尽量消化去除。,当要用两种或两种以上限制酶切割,DNA,时，必须选择好通用缓冲液，则两种酶才可同时切割。,酶切底物,DNA,应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醇，大于,10mM,的,EDTA,，,SDS,以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。,反应混合液中加入浓度为,0.1mg/ml,的,BSA,，,可维持酶的稳定性。,酶单位定义,:,活性单位：,在最适反应条件下,(,温度、,PH,值、离子浓度）,1,小时内完全酶切,1g,特定,DNA,底物所需的限制酶的量。,4.,酶切实验中的注意事项,:,反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。,反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及,DNA,大分子的完整。,反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。,终止酶反应可根据需要采用不同的方法：,酶切后不需进行下一步反应，可加入含,EDTA,的终止液终止反应。,若需进一步反应,(,如连接，切割等,),，可将反应管置,65,保温,20-30,分钟，以灭活酶，终止反应。,可用酚,/,氯仿抽提，乙醇沉淀。,4.,酶切实验设计的一般思路,:,软件检测目的需要转移操作的目的基因片段含有的酶切位点情况，选择基因内部不存在的内切酶。,确定双酶切的通用,buffer,确定内切酶的最适用量和酶切时间,进行酶切实验,3.,实验材料与仪器,质粒：重组质粒,BamH,核酸内切酶（,Takara,）,酶解缓冲液,(10K buffer),离心机，水浴锅,10,m,l,微量移液器，无菌的,0.5mL EP,管,4.,实验方法和步骤,Total ddH,2,O 10,Buffer,BamH,DNA(50ng/,m,l),10,m,l 7.2,m,l 1,m,l o.8,m,l 1,m,l,2),质粒,DNA,的限制性内切酶酶解,1),质粒中,RNA,的酶解,向,30,l,质粒溶液中加入,10mg/mL,Rnase,2,l,，,37,水浴酶解,0.5,小时。,置于,30,水浴酶解,3,小时。酶解完成后，分别进行电泳分析。,Sac1 4-12U/,m,l,Xba1 8-20U/,m,l,DNA,限制性内切酶对基因组,DNA,完全酶切的酶量和所用的时间是负相关的,如,Xba1:,50U,完全酶切需要,5h, 5U,完全酶切则需要,20h,碱裂解法小量制备质粒,DNA,一实验目的及背景,细菌质粒是一类双链、闭环的,DNA,，,大小范围从,1kb,至,200kb,以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。,其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。,质粒图谱的阅读,复制起始位点,Ori,即控制复制起始的位点。,原核生物,DNA,分子中只有一个复制起始点。而真核生物,DNA,分子有多个复制起始位点。,抗生素抗性基因 可以便于加以检测，如,Amp+,，,Neo,多克隆位点,MCS,克隆携带外源基因片段,P/E,启动子,/,增强子,Terms,终止信号,加,poly,（,A,）信号,可以起到稳定,mRNA,作用,质粒图谱的阅读,质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条,DNA,链，即质粒是环状双链,DNA,，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上,.,质粒特点,质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。,质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子,.,年由,Lederburg,正式命名为质粒。,质粒类型,质粒按复制方式分为两种类型：,松弛型质粒,严紧型质粒,松弛型质粒,1.,松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达,2000-3000,拷贝。,2.,严紧型质粒,严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白，质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合成抑制剂来增加。,其他分类：,克隆质粒 和 表达质粒,原核质粒、真核质粒、穿梭质粒,表达质粒,就是指带有启动子，增强子等等，使其在宿主体内不仅仅是可以复制，还能够通过转录翻印，在宿主内表达出相应蛋白的质粒,穿梭质粒,是指可以在多种宿主下复制。比如说通常能够在哺乳动物，酵母或者其他细菌复制表达的质粒，同时可以在大肠杆菌内复制。这样利于对质粒的分子生物学操作和大量制备。,质粒的应用,大多数基因工程使用松弛型质粒。,严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死的基因。,质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。,分离质粒,DNA,方法,从大肠杆菌中分离质粒,DNA,方法众多，目前常用的,碱裂解法；,煮沸法；,SDS,法；,羟基磷灰石层析法等,各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒,DNA,可用于酶切,连接与转化。,碱裂解法基本原理,在,pH 12.0-12.6,碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体,DNA,变性，而共价闭环质粒,DNA,仍为自然状态。,将,PH,调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体,DNA,之间交联形成不溶性网状结构，大部分,DNA,和蛋白质在去污剂,SDS,的作用下形成沉淀，而质粒,DNA,仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体,DNA,、,RNA,及蛋白质，质粒,DNA,尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒,DNA,。,实验试剂,1,菌种 含质粒,DNA,的大肠杆菌工程菌,DH5,2,LB,液体培养基,3,10mg/ml,氨苄青霉素,(Amp),溶液,4,含,Amp,的,LB,固体培养基,5,Tris-HCl,饱和酚,(pH8.0),6,溶液,含,50mmol/L,葡萄糖，,10mmol/ EDTA-Na,2,，,25mmol/L,Tris-HCl,(pH8.0),。（,8,磅高压）,7,溶液,含,200mmol/L NaOH,，,10g/L SDS,，,临用前用两种溶液的贮存液配制。,8,溶液, 5mol/L,醋酸钾溶液,60ml(,称取,29.4g,醋酸钾定容至,60ml),，,冰醋酸,11.5ml,和双蒸水,28.5ml,混合而成。,9,10mg/ml,RNase,A,10,TE,缓冲液,(pH8.0),11,其他试剂,氯仿、无水乙醇。,碱裂解法流程图,对数期菌体,溶液,III,中和,溶液,I,充分重悬,溶液,II,裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒,DNA,溶液,三实验方法,1,用接种环挑取,1,环冷冻保存的含质粒,DNA,大肠杆菌工程菌，划线接种于含有,Amp,的,LB,固体培养基平板上，,37,倒置培养约,12h(,过夜,),。,2,用接种针或消毒牙签挑取单菌落于盛有,5,ml LB,液体培养基,(,含,100,g/ml Amp),的试管中，,37,摇荡培养过夜。,3,取,1ml,菌液加入,1.5ml,的,EP,管中，,12 000r/min,离心,2min,，,弃上清，真空抽吸注意换头。,4.,加入预置,4,的,STE,溶液,100,l,重悬菌斑，,12 000r/min,离心,1min,，,弃上清。,5,在沉淀中加入溶液,100,l,重悬菌斑,，,4 ,静置,5-10min,。,6,加入,200,l,新鲜配制的溶液,，,颠倒数次，轻轻混匀，冰浴,5,10min(,溶液变透明，粘稠，,切忌延长,),。,7,加入溶液,150,l,，,颠倒混匀，冰浴,5,10min(,溶液出现白色沉淀,),8,15 000r/min,离心,10,min,，,将上清转移至另一,EP,管中。,9,加等体积酚抽提,1,次，,15 000r/min,离心,3,min,，,取上层水相转移至另一,EP,管。,10,加等体积氯仿抽提,1,次，,15 000r/min,离心,3,0sec,，,取上层水相转移至另一,EP,管。,11,加入,2,倍体积无水乙醇（预置,-20 ,），再加入,1/10,体积的,3M NaAc,，,-20 ,放置,30min,；,15,000r/min,离心,10min,，,弃上清。,12,用,70%,乙醇洗涤沉淀，,8 000r/min,，,离心,10,min,，,弃乙醇，室温下静置使乙醇挥发或真空干燥。,13,用,3,0,l ddH,2,O,溶解,DNA,沉淀，并加入,3,l,RNase,，,37,水浴,30min,，,-20,保存。,四、结果检测,1,、电泳：,质粒,DNA,的存在形式有,3,种：共价闭环,DNA,，,常以超螺旋形式存在；开环,DNA,，,此种质粒,DNA,两条链中有一条发生一处或多处断裂；线性,DNA,，,因质粒,DNA,的两条链在同一处断裂而造成。在电泳时同一质粒,DNA,的,3,种形式泳动速度：超螺旋线性开环,抽提产物经电泳分离、,EB,染色后，在紫外线灯下可观察到三条带，自前往后分别为：超螺旋、线性及开环质粒,DNA,。,2,、,定量检测,：,质粒,1,：,100,稀释，检测,OD260,（双链,DNA,在,1.6,1.8),，计算质粒,DNA,的浓度（,1 OD260 =50g,质粒,DNA/ml,）,菌体老化,碱裂解不充分,菌体中无质粒,溶液使用不当,请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养,可减少菌体用量或增加溶液的用量,不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。,溶液,在温度较低时可能出现浑浊，置于,37,保温片刻直至溶解为清亮的溶液,。,五、质粒,DNA,提取常见问题,问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？,原因,对,策,混有蛋白,混有,RNA,混有基因组,DNA,不要使用过多菌体。重新纯化,DNA,，去除蛋白、多糖、多酚等杂质,加入,RNaseA,室温放置一段时间,加入溶液,II,和,III,后,防止剧烈振荡，可能把基因组,DNA,剪切成碎片从而混杂在质粒中。细菌培养时间过长会导致细胞和,DNA,的降解，培养时间不要超过,16,小时。,五、质粒,DNA,提取常见问题,问题二：质粒纯度不高，如何解决？,原因,对,策,谢谢！,