质粒DNA的抽提、纯化与检测

单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,分子生物学实验（综合性）,质粒,DNA,的抽提、酶切及电泳鉴定,常规,PCR,技术,感受态细胞的制备及重组质粒的转化,真核细胞基因组,DNA,的分离、纯化与检测,YL-,1,质粒,DNA,的抽提、酶切及,电泳鉴定,实验,YL-,2,实验安排,上午：质粒,DNA,的提取与纯化,中午：,质粒,DNA,的酶切,下午：,电泳鉴定,质粒,(plasmid),：是细菌、酵母菌和放线菌中自然存在的独立于染色体外、具有复制能力的小分子共价闭合环状双链,DNA,。,现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因。,是重组,DNA,技术中重要的载体。,质粒,作为载体的质粒：,多克隆位点,选择标记,容纳较大的外源,DNA,质粒的特性：,相对独立性,独立的复制单位,赋予宿主细胞一些表型,与宿主菌染色体,DNA,不同,质粒,提取质粒,DNA,的,目的与意义,基因载体,/,基因克隆,/,基因工程：,在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。,如何获得批量的纯化质粒,DNA,分子？,（一）载体的制备,：,质粒,DNA,的提取与纯化,提取方法概述,基本步骤,培养细菌使质粒扩增,收集和裂解细菌,分离、纯化质粒,常用方法,碱裂解法,煮沸裂解,试剂盒法,氯化铯密度梯度离心法,碱裂解法分离纯化质粒,DNA,基本原理：,利用质粒,DNA,与染色质,DNA,变性与复性的,差异。,当菌体在,NaOH,和,SDS,溶液中裂解时，蛋白质与,DNA,发生变性；当加入中和液后，质粒,DNA,分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体,DNA,不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。,原理示意图,溶液,：,50mmol/L,葡萄糖,（,pH8.0,）,10mmol/L EDTA,，,25mmol/L,Tris-HCl,溶液,：,0.2mmol/L,NaOH,1% SDS,溶液,：,pH4.8, K,+,=3mol/L,（,pH4.8,）,Ac,-,=5mol/L,重悬细菌；保护和缓冲作用,裂解细菌,蛋白、,DNA,变性,中和,NaOH,质粒,DNA,复性,染色质,DNA,、蛋白不能复性,重要试剂,碱裂解法,提取质粒的,流程,离心收集菌体,溶液,III,中和,溶液,I,充分重悬,溶液,II,裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒,DNA,溶液,1.,取,1mL,菌液于,1.5mL,离心管中，,10000rpm,离心,1min,，,弃上清,。,2.,将细菌沉淀悬浮于,100,L,冰预冷的 溶液,I,中，,振荡混匀,。,3.,加,200,L,新鲜配制的溶液,II,，盖紧管盖，上下,轻柔,颠倒离心管混匀,5,次（勿强烈振荡），冰上放置,2min,。,4.,加入,150,L,预冷的溶液,III,，将管,轻柔上下,颠倒数次（,6-8,次）混匀，见白色絮状沉淀，冰上放置,3min,。,碱裂解法提取质粒操作步骤,步骤,1,中可用移液枪将残留液体吸取，勿吸到沉淀。,步骤,2,中应充分悬浮，使细胞分散混匀。,步骤,3,、,4,中切记动作轻柔，应缓慢上下颠倒离心管混,匀 ，勿强烈振荡，否则质粒容易断裂。,菌液：,E coli,JM109,菌株,(,含,p,UC,19,-X,基因重组质粒,),5. 12000rpm,离心,5min,，小心,吸取上清,至干净的,1.5mL,离心管中。,6.,加等体积（约,450,L,）酚,:,氯仿，混匀，,12000rpm,离心,5min,，,取上清,移至另一,1.5mL,离心管中。,7.,加,1mL,冰预冷无水乙醇，上下颠倒混匀几次，室温放置,10min,；,12000rpm,离心,5min,，,弃上清,。,8.,加,1mL,冰预冷,70%,乙醇漂洗沉淀，,12000rpm,离心,5min,。,9.,弃上清,，室温放置,5-10min,，晾干沉淀。,10.,加,20,L,含,RNase,（无,DNase,）的,TE,溶解,DNA,，,37,水浴消化,15-30min,以去除,RNA,。,碱裂解法提取质粒操作步骤,步骤,5,、,6,中吸取上清液时应避免将交界面的蛋白、染,色体,DNA,也吸走。,不要让质粒完全干燥，否则将难以溶解。,下一步实验用,提取质粒后分装,每人最终得到,20,L,质粒,DNA,，其中,10,L,用于酶切，,5,L,用于电泳，其余,5,L,用于下次的转化实验，切记！,作好标记，,放在讲台上,20,L,质粒,5,L,质粒,（,冻存,）,10,L,质粒,（,酶切,）,5,L,质粒,（,加入,15,L,TE,）,实验注意事项,移液枪的正确使用,标记好自己的离心管,加不同溶液要换枪头,转移上清时不要吸到沉淀,使用酚,:,氯仿注意安全,离心机的使用：严格平衡,注意,（二）,质粒,DNA,的酶,切及,电泳鉴定,识别特异的,DNA,序列，并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶。,常用限制性内切核酸酶有高度特异的碱基识别序列和切割点。,例如,EcoR,的切割位点：,G,A A T T C,C T T A A,G,Hind,的切割位点,：,A,A G C T T,T T C G A,A,限制性核酸内切酶,（,restriction,endonuclease,）,本实验所提取的质粒为重组质粒，含有插入的目的片段。如果用,EcoR,和,Hind,同时切割重组质粒（含两个单一酶切位点），,就产生,两条带相应酶切位点的线性,DNA,分子。,3.4kb,2.5kb,0.9kb,EcoR,Hind ,使用限制性内酶切的原则,限制酶的热不稳定性，选择合适的条件；,避免反复冻融，保持低温（冰浴）下进行；,酶的用量可参照酶单位的定义确定；,两种以上的酶切割,DNA,时应选择合适的缓冲液；,酶切反应必须使用无菌离心管及吸头号，避免交叉污染。,质粒,DNA 10,L,10M Buffer 2L,EcoR,1L,Hind, 1L,ddH,2,O 6,L,21,合计,20L,准备室老师已将其配成,2,限制性酶反应混合液,双酶切体系的建立,重组质粒的酶切反应,5,L,质粒,（,冻存,）,5,L,质粒,（,加入,15,L,TE,）,酶切反应体系,质粒,DNA 10L,2,限制性酶反应混合液,10L,20,L,质粒,10,L,质粒,（,酶切,）,共计,20,L,37,水浴保温,2-3h,2,限制性酶反应液包含：,10,酶反应缓冲液、,EcoR,I,、,Hind,III,核酸电泳,核酸分子是两性解离分子，在,pH8.0,pH8.5,时，磷酸全部解离，使得核酸分子带负电荷，向电场正极移动。,具有不同的相对分子,质量的,DNA,片段在凝胶中泳动速度不一样，因而可依据,DNA,分子的大小或,构型,来使其分离。,质粒的三种构型,在细胞内,质粒,常以共价闭环的超螺旋形式存在,如果两条链中有一条的一处或多处断裂，分子就能发生旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子,如果两条链均断开，即为线状DNA,超螺旋,DNA,（,CCC DNA,）,开环,DNA,（,OC DNA,）,线状DNA,(L DNA),电泳时，三者泳动速度大小关系（？）,最快,中,最慢,重组质粒双酶切电泳,酶切质粒线状质粒,DNA,标准,插入片段,线性载体,DNA,标准（,Marker,） 是分子量不同的,DNA,片段，主要用途就是,DNA,分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题以及估算条带的大小。,质粒,DNA,电泳步骤,制胶,取酶切后的质粒,DNA,溶液,20,L,、酶切对照的质粒,DNA,溶液,20,L,，各加,5,上样缓冲液,5,L,，混匀后，用移液枪慢慢将混合物加至样品孔中；另加入,5,L,DNA Marker,至另一样品孔中。,电压,120V,，电泳约,40min-1h,。,点样：,开环构型,线性构型,超螺旋构型,（希望得到最多）,预期电泳结果,点样孔（如果纯化不好，就可能有,DNA-,蛋白复合物残留）,RNA,残留,酶切后,提取的质粒,2.5Kb,0.9Kb,小结,1,质粒的提取：碱裂解法分离纯化质粒,DNA,，利用质粒,DNA,与染色质,DNA,变性与复性的差异。,2,质粒的酶切：限制性核酸内切酶可以识别特异 的,DNA,序,列，并切割双链,DNA,。本实验中,Eco,R,I,、,Hin,d,III,将,3.4,Kb,的质粒双酶切为,2.5 Kb,和,0.9Kb,的两个片段。,3,电泳分析：利用不同的分子量的,DNA,片段在琼脂糖凝胶,中泳动速度不一样使其分离。,思考题,1.,碱裂解法分离纯化质粒,DNA,基本原理是什么？结合基本原,理分别讲述溶液,、,、,发挥怎样的作用。,2.,实验操作中应注意哪些步骤？否则可能产生怎样的后果？,3.,如何通过电泳分析判断得到的质粒,DNA,的质量？,4.,如果质粒,DNA,中残留有蛋白质或,RNA,，电泳后会出现什么结,果？,