组织捣碎及细胞破碎

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1.2.2 组织捣碎及细胞破碎,（一）细胞壁的结构和特点,（二）细胞破碎机理,（三）细胞破碎方法,1,教育技术中心,1.植物细胞,2.微生物细胞,G,+,细菌和G,酵母细胞,真菌菌丝细胞壁,（一）细胞壁的结构和特点,2,3,成,分,G+,G -,肽聚糖磷壁酸类脂质蛋白质,含量很高（,30,95,）含量较高（,50,）一般无（,2,）,0,含量很低（,5,20,）,0,含量较高（,020,）含量较高,革兰氏阳性细菌的和革兰氏阴性细菌细胞壁构造,革兰氏阳性细菌与阴性细菌的细胞壁成分,(,占细胞壁干重的,%),4,5,6,（二）细胞破碎的机理,压缩力和剪切力,改变细胞壁或细胞膜的结构，增大目标产物的溶出率,完全溶解细胞的保护屏障细胞壁,7,8,（三 ）细胞破碎的方法,9,1.物理破碎,（1）高压匀浆器,10,（1）高压匀浆法,工作原理：剪切，碰撞,影响高压匀浆器破碎效果的因素,压力：通常采用的压力为,55,70Mpa,温度：,通过匀浆器的次数：,1,2,阀与阀座间距,高压匀浆器原理利用高压迫使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂,从低压环境释放出来。,11,12,（1）高压匀浆法,注意：,易造成堵塞的团状或丝状真菌；,较小的革兰氏阳性菌；,含有包含体的基因工程菌 。,13,珠磨机,工作筒,（2）珠磨法,14,搅,拌器,15,原理：在膜腔中装入小玻璃球或小钢球，在搅拌浆的作用下，它将使细胞悬浮液与细胞悬浮液，细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起发生碰撞、剪切，使细胞在某种程度上破碎，再由液珠分离器分开、排出。,（这些装置的主要缺点是在破碎期间样品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。）,构件：微珠、冷却装置、搅拌浆、液珠分离器、物料进出口。见图,16,高速珠磨机,17,工作原理：剪切，碰撞,18,（2）珠磨法,影响因素珠磨效率的因素,珠体的大小：实验室规模，珠径为,0.2mm,较好，工业规模，不得,0.4mm,珠体在磨室中的装量：控制在,80%,90%,；,搅拌速度：,操作温度：操作温度在,5,40,范围内,被处理细胞的特性：,19,（3）超声波破碎法,工作原理,空穴现象引起工作液局部区域压力差 ，从而产生一个极为强烈的冲击波压力，由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发生流动，从而使细胞破碎。,影响因素,仪器的功率,介质的离子强度,pH,值,菌体的种类和浓度,20,电声超声波发生器,21,（4）渗透压冲击法,细胞 高渗溶液 脱水 低渗溶液,吸水破裂,反复冻融法,干燥法,X-press,法（冻结,-,撞击法）,22,2.化学法,（1）酶法,原理：,外加酶法,细菌类：溶菌酶 ，,G,+,需配合,EDTA,放线菌：溶菌酶,23,外加酶法,酵母和真菌：蜗牛酶、纤维素酶、多糖酶等,植物细胞壁：纤维素酶，果胶酶；,24,外加酶法,注意事项,需要选择适宜的酶、酶系统和特定的反应条件；,在选择酶系统时，须根据细胞的结构和化学组成来选择；,常结合其他方法预先处理；,25,外加酶法,外加酶法的特点,优点：选择性释放产物；条件温和；核酸泄出量少；细胞外形完整。,不足,溶酶价格高,通用性差,产物抑制的存在；如甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,26,酶自溶法,（2）,酶自溶法,常采用加热法或干燥法,比如谷氨酸产生菌，加入0.028mol/L Na,2,CO,3,和0.018mol/L NaHCO,3,配成pH10.0的缓冲液，使成3%的悬浮液加热至70，保温搅拌20min，菌体即自溶。又如：酵母自溶需在45,50下保温12,24h,。,27,化学试剂法,（3）,化学试剂破碎法,表面活性物质,EDTA,螯合剂,有机溶剂,变性剂,28,五、选择破碎方法的依据,1处理量的大小；,2细胞壁的强度和结构；,3目标产物对破碎条件的敏感性；,4破碎后固液分离的难易程度；,5.选择性地释放目标产物。,29,选择性地释放目标产物,仅破坏或破碎存在目标产物的位置周围,细胞膜附近，采用温和的破碎方法如酶溶法、渗透压冲击法、冻融法；,细胞质内，机械破碎,选择性溶解目标产物,当目标产物与膜或壁结合时，调整溶液,pH,值、离子强度、添加与目标产物具有亲和性的试剂如螯合剂、表面活性剂等，使目标产物容易释放出来,30,六、细胞破碎效果的检查,1.直接测定法,检测破碎前后的完整细胞数量,2.目的产物测定法,细胞破碎后，通过测定破碎液中目的产物的释放量来估算破碎率。,3.测定导电率,31,