第八章酶的定向进化

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 酶的定向进化,8.1,简介,通常可通过两条途径获得具有新功能和特性的酶,一是从大量未知的生物种系中寻找；,二是改造现有已知的酶。,人工改造之定点突变,首先分析蛋白质的三维空间结构，搞清结构与功能的关系，然后采用定点突变技术改变蛋白质中的,个别氨基酸残,基，从而得到新的蛋白质，理性化设计。,定点突变技术对天然酶蛋白的催化活性、抗氧化性、底物特异性、热稳定性及拓宽酶反应的底物范围、改进酶的别构效应等进行了成功的改造。,定点突变的缺点,只能对天然酶蛋白中少数的氨基酸残基进行替换、删除或插入，不改变酶蛋白的高级结构，因而对酶功能的改造较有限。,本法仅适用于三维结构清楚、结构和功能的相互关系也较清楚的酶。当对酶结构不甚了解时，定点突变就无能为力了,.,定向进化,利用基因的可操作性，模拟自然界的演化进程的非合理设计方案,定向进化,(directed evolution),、杂合进化,(hybrid evolution),等。,定义,:,酶的体外定向进化,(in vitro directed evolution),是在人工模拟自然进化过程的条件下，通过容错,PCR,、,DNA,改组、交错延伸技术、随机引物引导重组和递增截短技术等方法对编码酶的基因进行突变和体外重组，,经高通量筛选,获得性能更优良或全新的酶。本法不需了解酶的结构信息，因此称为非理性化设计。,定向进化的历史,1,萌芽阶段,首先在分子水平上进行改造 单一分子的是,Sol Spiegelman,在,20,世纪,60,年代,利用,RNA,噬菌体,Q,进行的试验,目的是证明达尔文的自然选择也可在非细胞体进行,.,病毒基因组,Q,复制酶扩增,DNA,突变库,复制快的保留,(,能被,Q,酶选择识别的,),2,奠基阶段,1981,年，,Hall B G,等报道了他们定向改变了大肠杆菌,K12,中的第二半乳糖苷酶的底物专一性，开发出对几种糖苷键有水解能力的酶。,HallB G,等利用,lacz,缺陷型的菌株为宿主菌，分别在含有某种碳源的培养基上培养从酶的自发突变库中筛选出分别可以水解半乳糖、乳果糖、乳糖酸的突变酶，而野生型的酶不能水解这些底物。,3,发展阶段,易错,PCR (error-prone PCR),和,DNA,改组方法被成功开发,标志着酶分子定向进化技术的成熟,.,1992,年,Gram H,等用噬菌体呈现技术体外筛选抗体时，用易错,PCR,向抗体的重链可变区和轻链可变区引入突变。,Stemmer,将,DNA,改组方法引用到酶分子定向进化中，他用,内酰胺酶作为模型分子，对其正向突变库进行,DNA,改组，以逐渐增加头孢氨噻的浓度为筛选压力，经过三轮,DNA,改组获得酶活力增加,32000,倍的突变体。,8.2,酶的定向进化常用方法,一、易错,PCR,技术为代表的无性进化,二、,DNA,改组技术为代表的有性进化,一、易错,PCR,技术为代表的无性进化,无性突变是向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选。主要的手段包括易错,PCR,、盒式诱变、随机定位诱变等,易错,PCR,是在采用,Taq,酶进行,PCR,扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如提高镁离子浓度，加入锰离子改变体系中四种,dNTP,的浓度等，使用低保真度的,Taq,酶，从而向目的基因中以一定的频率随机引入突变构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。,易错,PCR,遗传变化只发生在单一分子内部,属于无性进化。较为费力、耗时,一般多用于较小基因片段,( 800bp),的改造。通常,经一轮的易错,PCR,、定向筛选,很难获得令人满意的结果。由此发展出了连续易错,PCR(Sequential error-prone PCR) ,将一次,PCR,扩增得到的有益突变基因作为下一次,PCR,扩增的模板,连续反复进行随机诱变,使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变,。,实例,枯草杆菌蛋白酶,:,洗涤剂合成、鞣革和医药领域的重要工业酶制剂。,Chen,和,Arnold,采用易错,PCR,对该酶进行了体外进化研究。他们通过降低反应体系中,dATP,的浓度,对编码该酶从第,49,位氨基酸到,C,端的,DNA,片段进行易错,PCR ,经筛选得到的几个突变株在高浓度的二甲基甲酰胺,(DMF),中酶活性明显提高,突变体,PC3,在,60 %,的,DMF,中,酶活力是野生型的,256,倍。将,PC3,再进行两个循环的定向进化,得到的突变体,13M,酶活力比,PC3,还要高,3,倍。,化学诱变剂介导,Taguchi,等 研究表明，用羟胺（,hydroxylamine,）在,65,下直接处理带有目的基因片段的质粒也可产生随机突变，然后用限制性内切酶切下突变的基因片段，克隆到一定的表达载体中进行功能筛选。应用此技术将带有枯草杆菌蛋白酶基因的质粒进行随机突变，经酶切、克隆表达后得到,13,个突变株，在,10,下其,Kcat/Km,比出发菌株提高,1,倍。,由致突变株产生,Greener,等构建了一株,DNA,修复途径缺陷的大肠杆菌突变株,XL1-Red,，其体内的,DNA,突变率比野生型高出,5000,倍。将带有拟突变基因的质粒转化到,XL1-Red,菌株内培养过夜，可产生随机突变，频率一般为,1/2000,。,本法产生的随机突变的特点为：（,1,）每代筛选出,1,个最佳的突变体作为下一代的亲本，通过累积正突变加快进化进程，但要将有益的突变组合到一起较困难 ；（,2,）常会发生突变的复原；（,3,）无法删除有害突变，连续突变也会累积有害突变，往往导致进化提前终止。,二、,DNA,改组技术为代表的有性进化,在酶分子无性进化策略中，一个具有正向突变的基因在下一轮易错,PCR,过程中继续引入的突变是随机的，而这些后引入的突变仍然是正向突变的概率是很小的。,开发出,DNA,改组等基因重组策略将已经获得的存在于不同基因中的正突变结合在一起形成新的突变基因库,DNA,改组,(DNA shuffling),又称为有性,PCR (Sexual PCR) ,其目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会,以致更大的变异,获得具有最佳突变组合的酶。基本操作过程如下,:,靶基因经随机突变产生含不同突变类型的亲本基因群,用,DNase I,随机切割,;,得到的片段经过不加引物的多次,PCR,循环,在该过程中,这些片段之间互为引物和模板进行扩增,直至获得全长基因,;,再加入基因的两端引物进行常规,PCR ,最终获得发生改组的基因库,(,图,1),。该技术不仅可加速积累有益突变,而且可实现目的蛋白多种特性的共进化,所以无论在理论上,还是在实际应用中,均优于连续易错,PCR,。,实例,-,内酰胺酶是一种水解头孢类抗生素的微生物酶,Stemmer,等运用,DNA shuffling,技术成功地实现了对该酶的定向进化。他们从对头孢类抗生素具有较弱抗性的,-,内酰胺酶基因出发,经随机突变、,DNA,改组和定向筛选,得到上百个对头孢类抗生素抗性较大的克隆,以这些克隆携带的酶基因作为下一步,DNA,改组的起始基因库,经,3,个循环的改组和筛选,最终获得了一个使宿主细胞对头孢类抗生素抗性性能提高,16 ,000,倍的进化酶。,特点,（,1,）,DNase I,酶切获得片段大小一般应控制在,20,50bp,；,（,2,）伴随重组程的不断重复，可有少数点突变同时发生；,（,3,）可体外实现同源序列间的改组，创造亲本基因群中突变尽可能组合在一起的机会，加速累积有益突变最终获得较理想的性状改良的突变体,基因家族之间的同源,重组,Family shuffling,Family shuffling,指用,DNA shuffling,技术,改组进化上相关的一系列基因。,当从自然界中存在的基因家族出发,利用它们之间的同源序列进行,DNA,改组。由于每一个天然酶的基因都经过千百万年的进化,并且基因之间存在比较显著的差异,所以获得的重组基因库充分体现了基因的多样化，又最大限度的排除了那些不需要的突变。,实例,Stemmer,等从不同种微生物中选择编码头孢菌素酶的,4,个同源基因,对它们进行单独进化和同源重组进化,来对这两种进化模式进行比较。在对单基因进化得到的突变酶中,对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了,8,倍,而采用,Family shuffling,的方法使抗性比其中两种微生物来源的天然酶提高,270,倍,比另两种酶提高了,540,倍。,改进方法,其它改组方法,交错延伸重组,( StEP : Stagger extension process),随机引物体外重组,( RPR: Random,2,priming,in vitro,recombination),临时模板随机嵌合生长,( RACHITT : Random chimeragenesis on transient templates),8.3,酶分子定向进化的筛选策略,与基因的定点突变不同,在酶分子的定向进化中,突变是随机发生的,但通过筛选特定方向的突变,便可限定进化的趋势,再加上适当的控制实验条件,不仅可大大的减少工作量,还加快了酶某种特征的进化速度。,通常,采用的定向筛选方法必须灵敏,且应与目的性质相关,常用方法,利用底物显色反应,改变培养条件,(,如逐步提高培养温度,或改变培养基的,pH,等,),利用某些蛋白的固有性质,如产生绿色荧光,高通量筛选,(HTS: High Throughout Screening) ,该技术可以根据待测样品的合成路线分为液相和固相筛选,也可以根据筛选目标物分为纯蛋白受体亲合性筛选,酶活性筛选,细胞活性筛选等。,HTS,HTS,现有的方法有,:,固相筛选、使用放射性染料筛选、荧光筛选、闪烁接近化验、,LISA,、利用细胞的功能筛选和利用小鼠显型的表型遗传学筛选等等。,高通量筛选,( HTS),体系将组合化学、基因组研究、生物信息和自动化仪器、机器人等先进技术进行了有机组合,快速 筛选得到目的物。,90,年代初期,一个实验室采用传统的方法,借助,20,余种药物作用靶位,一年内仅能筛选,75 000,个样品,;,到了,1997,年,HTS,发展的初期,采用,100,余种靶位,每年可筛选,1 000 000,个样品,;,而到,1999,年,由于,HTS,的进一步完善,每天的筛选量就高达,100 000,种化合物,因而,称之为超高通量筛选。,荧光,HTS,8.4,实际应用,一、提高酶分子的催化活力,这是对酶分子进行改造的最基本的愿望之一，大多实验都涉及对目的酶催化活力的提高，例如，吉林大学分于酶学工程教育部重点实验室张今教授课题组对,L,天冬氨酸酶，等进行定向进化研究、以提高催化活力。,实例,1,；,L,天冬氨酸酶定向进化研究,L,天冬氨酸酶是一种重要的工业用酶，可催化富马酸和氨生成,L-,天冬氨酸。,L-,天冬氨酸在医药、食品、化工等领域具有非常广泛的用途。由于天冬氨酸酶的活性部位尚未完全确定，催化机理也需进一步证实，在这种条件下通过酶的合理化设计来进一步提高酶活力具有一定困难。为此，采用定向进化的方法对酶基因进行改造，以期获得较高活力的酶。,根据定向进化的基本思想，作者确定了易错,PCR,一筛选一,(,优势突变重组一筛选,)n,的实验路线。共进行了,4,轮易错,PCR,，每一轮易错,PCR,约筛选了,3000,个菌落。最终得到了一株酶活力提高,28,倍的突变体。对天然酶和进化酶的酶学性质进行了分析，结果表明进化酶的,pH,稳定性和热稳定性均优于天然酶，因此更适合于工业化生产,L,天冬氨酸。,进化酶基因测序结果表明共发生了,7,个碱基突变，其中,3,个点突变引起了氨基酸的改变：,Asn,217,Lys,，,Thr,233,Arg,，,Va,l367,Gly,。,Thr,位于亚基间相互作用的界面上，距离,Lys,327,1,5nm,以内，推测突变后的,Arg,与底物,COOH,的碳基氧作用，一方面进一步加强了酶与底物的亲和力，另一方面更加稳定了负碳离子中间体从而引起了进化酶,K m,的下降和,Kcat,值的提高。,L,天冬氨酸酶活性位点的重要催化残基没有改变，暗示该进化酶的催化机理与天然酶相同。,二、提高酶分子稳定性的定向进化,一般单氨基酸残基突变造成酶的熔化温度,(Tm),的升高为,12,，而更多的提高比较罕见。例如已经确定的,T4,溶茵酶,11,个不同的单点突变株将酶,Tm,提高的范围是,0,8,一,1,4,；已发现的,8,株大肠杆菌核酸酶,HI,单点突变中，,7,株,Tm,提高了,o,74,2,，而另一个氨基酸取代可能因为填充了蛋白质分子内部的一个空穴而导致,Tm,产生了,7,8,的提高。,三、适应人工环境中提高酶活力或稳定性的进化,利用有机溶剂可以提高底物的溶解度或提高专一反应的速率而天然酿在有机溶剂中，即使有时能保持天然构象也极易失活因此在这种酶分子的应用环境中对配分子定向进化就十分必要。例如枯草杆菌蛋白酶在,60,DMF,中的定向进化，提高了酶的活力和稳定性。最近利用定向进化和基因重组，创造了对硝基苄基酯酶在,DMF,中使合成抗生素中间体脱保护，在,30,DMF,中配活力提高了,100,倍。,天然酶在生物体内不会接触到人工添加的去离子螯合剂，而酶在应用于洗涤剂工业中的时候就必须在螯合剂存在的环境中保持活力，因此有必要改变大多数应用的蛋白酶依赖金属离子来保持其活力或稳定性的性质。,Bryant,及其同事进化了一株在缺少,Ca,2+,，仍稳定的枯草杆菌蛋白酶。他们随机突变了,10,个氨基酸残基，删除了结合,Ca,2+,的凸环。在无,Ca2+,的溶液中进化酶半衰期比野生型长,12,5,倍。后来的几轮突变与筛选又产了,7,株更加稳定的不依赖于,Ca,2+,的进化酶。,四、提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化,增加底物专一性，可以使酶更加适应工业化生产。,Gulick,实验进化了谷胱甘肽转移酶，使其作为更有效的药物解毒酶，分离到了一株谷胱甘肽转移酶，它对于癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了,9,倍。,五、对映体选择性的定向进化,定向进化方法提高,R,转氨酶的对映体选择性。转氨酶可应用于生产几种手性氨基酸，大多数转氨酶转化酮酸的效率都高于,99,，但是一种,S,型选择性的转氨酶转化,丁酮，仅有,65,的手性专一性。通过对,10 000,个随机突变的菌株的筛选，获得了,10,个手性专一性在,80,一,94,之间的酶，有的个别突变体专一性达到了,85,一,91,。,六、变换催化反应专一性,对映体的选择性合成是酶催化反应的一种重要的应用，但是许多酶分子自身对底物较强的选择性阻止了科学家们投入更大的精力去研究新的立体选择性酶，也妨碍了现在已经使用的各种酶的商业化。然而，最近的研究表明立体选择性酶的专一性是可以变化的。,8.5,总结与展望,酶分子定向进化策略是非常有效的、更接近于自然进化过程的一种蛋白质工程研究新策略，是分子进化的一个重要分支，是组合化学的思想和方法在酶分子改造上的应用。同时，酶分子的定向进化设计因为研究对象的特殊性，而在其思想和方法上具有自身特点。酶分子定向进化设计在组合化学的随机库,(,突变库,),和筛选的基础上，增加了利用基因改组技术的有性进化思想，与自然进化更加接近有效地解决了对于酶这样的大分子物质其天文数字级别的突变库，与有限的筛选容量之间存在的矛盾。以基因重组技术为表现形式，有性进化思想对于酶,(,蛋白质,),的改造具有里程碑式的意义，因此定向进化是在组合化学思想和方法基础上的又一次飞跃,.,实例：大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化,