微生物的培养与应用课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,课题1 微生物的实验室培养,专题,2 :,微生物的培养与应用,了解有关培养基的基础知识，进行无菌技术的操作，进行微生物的培养。,课题目标：,掌握,培养基的制备,、,高压蒸气灭菌,和,平板划线法,等基本操作技术，熟练、规范地进行无菌操作，成功地培养微生物。,无菌技术的操作。,课题重点和难点：,技能目标：,1,、微生物包括五类,：,病毒,细菌,放线菌,真菌,原生动物,2,、特点：,结构都相当简单,个体多数十分微小,.,通常要用,光学显微镜或电子显微镜,才能看到，有的甚至没有细胞结构。且体内一般不含有叶绿素,.,不能进行光合作用。,原核生物界,原生生物界,真菌界,病毒界,一、微生物基础知识,细菌的外形与大小,细菌：,单细胞不分枝的原核微生物,。,细菌细胞,微小而透明,，通常用适当染料,染色,后显微镜观察,A.,球菌,B,.,杆菌,C.,弧菌,常见的三种细菌典型形态,有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做,芽孢,。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。当环境适宜（如温度、水分适宜）的时候，芽孢又可以萌发，形成一个细菌。,菌落：,单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落,。,菌落是鉴定菌种的重要依据。,细菌的菌落特征因种而异,放线菌,结构：,单细胞原核,分支状的菌丝,(,基内菌丝、气生菌丝,),链霉素、土霉素、四环素、,氯霉素、红霉素、庆大霉素,微生物中发现了几千种抗生素，其中,2/3,是,由放线菌产生的,应用,:,病毒的结构,SARS,病毒,禽流感病毒,如图是酵母菌电子显微镜下的形态结构,酵母菌和霉菌,青霉,真菌,二、培养基,1,、概念,:,培养基（培养液）是,由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的营养基质,。,(1),根据,物理性质,分,固体培养基,用于微生物的分离计数,半固体培养基,观察微生物的运动、鉴定菌种,液体培养基,常用于工业生产,(2),根据,化学成分,分,合成培养基,成分明确,常用于分类、鉴定,天然培养基,成分不明确,常用于工业生产,2.,培养基的种类,固体培养基,半固体培养基,液体培养基,主要用于微生物的分离、计数等,主要用于观察微生物的运动、鉴定菌种等,主要用于工业生产,需加入凝固剂，如琼脂,(3),根据,用途,分,选择培养基,在培养基中加入某种化学物质,以抑制不需要的微生物的生长,促进所需要的微生物的生长,如加高浓度的食盐,抑制多种细菌生长,分离到金黄色葡萄球菌,鉴别培养基,在培养基中加入某种指示剂或化学药品,用以鉴别不同种类的微生物,如伊红和美蓝,与大肠杆菌的代谢产物结合,使菌落呈深紫色,并带有金属光泽,可以用来鉴别大肠杆菌,选择培养基,加入青霉素的培养基,分离酵母菌、霉菌等真菌,加入高浓度食盐的培养基,分离金黄色葡萄球菌,无氮源培养基,分离固氮菌,无碳源培养基,分离自养型微生物,加入青霉素等抗生素的培养基,分离导入了目的基因的受体细胞,4,、培养基的营养构成：,一般都含有,水、碳源、氮源和无机盐,等营养物质，,另外还需要满足微生物生长对,pH,、,特殊营养物质，例如：,生长因子,(,即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶,),以及,氧气,、,二氧化碳,、,渗透压,等,的要求。,3,、不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方,(,参考教材附录内容,),概念,来源,作用,碳源,凡是能为微生物提供,生长繁殖,所需碳元素的营养物质,无机碳源,CO,2,NaHCO,3,等,有机碳源,糖类,脂肪酸,花生粉饼,石油 等,构成细胞物质和一些代谢产物,异养微生物的主要能源,(1),微生物的碳源,自养型和异养型微生物分别能利用哪类碳源物质？,思考,概念,来源,作用,氮源,无机氮源,N,2,、,NH,4,+,、,NO,3,-,、,NH,3,等,有机氮源,尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸 等,凡是能够为微生物提供所需氮元素的营养物质,主要用于合成蛋白质、核酸,及含,N,的代谢产物,(2),微生物的氮源,注：对于异养微生物来说，含,C,、,H,、,O,、,N,的化合物既是碳源，又是氮源。,概念：,成分：,作用：,为什么不可缺少？,常见的生长因子：,微生物生长不可缺少的微量有机物,有机物,酶和核酸的组成成分,缺乏合成这些物质所需酶或合成能力有限,维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等,(3),生长因子,三、无菌技术,1,、无菌技术的概念,无菌操作泛指,在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,无论是随后将要学到的,倒平板、平板划线操作，还是平板稀释涂布法,，其操作中的每一步都需要做到,“,无菌,”,，即,防止杂菌污染,。,只有熟练、规范地进行无菌操作，才可能成功地培养微生物。,（）,消毒定义：,利用较为温和的,化学或物理,方法，杀死物体表面或内部的部份,微生物（不包括芽孢和孢子,),。,2,、消毒与灭菌的概念及两者的区别,（,2,）灭菌的定义：,以强烈的化学剂或物理方法消灭体内外,所有,微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到,完全无菌,之过程。 灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,煮沸消毒法,:100,煮沸,5-6min,。,巴氏消毒法,:70-75,下煮,30min,或,80,下煮,15min,化学药剂消毒法,:,用,75%,酒精等进行皮肤消毒,;,氯气消毒水源，或喷洒石炭酸或煤酚皂溶液等液。,紫外线消毒,:,利用紫外线照射,30min,。,(1),消毒的方法：,3.,常用的消毒与灭菌的方法,灼烧灭菌,：各种,金属用具,可直接在酒精灯火焰的,充分燃烧层灼,烧，可迅速彻底地灭菌。,干热灭菌,：用干热灭菌箱在,160-170,下加热,1-2h,用于,能耐高温的、需要保持干燥的物品,。,高压蒸汽灭菌,：,100kPa,、,121,下维持,15-30min.,(2),灭菌的方法：,四、微生物实验室培养的基本操作程序,1,、计算,2,、称量,3,、溶化,4,、灭菌,5,、倒平板,（,二,）,纯化大肠杆菌,（,一,）,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1,、平板划线法,2,、稀释涂布平板法。,实 验 操 作,（,一,）,制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.,牛肉膏蛋白胨固体培养基配方,(,计算,),物质,牛肉膏,蛋白胨,NaCl,琼脂,水,重量,5g,10g,5g,20g,定溶至,100mL,2.,称量,按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。,蛋白胨是一种外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。它可以作为微生物培养基的主要原料，在抗生素、医药工业、发酵工业、生化制品及微生物学科研等领域中的用量均很大；不同的生物体需要特定的氨基酸和多肽，因此存在着各种蛋白胨，一般来说，用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（酪蛋白、肉类）和植物蛋白（豆类）等两种。,牛肉膏,牛肉浸膏,成分：是采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。,牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。该产品广泛应用于生物制药发酵及各种培养基的制备。 当中它起的主要作用是补充蛋白胨以及其它氮源的营养不足。一般的用量为,0.3%,0.5%,。,牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的,细菌基础培养基,，有时,又称为普通培养基,，由于这种培养基中含有一般细菌生长繁殖所需要的最基本的营养物质，所以可供作微生物生长繁殖之用。,基础培养基含有牛肉膏、蛋白胨、,NaCl,和琼脂。,其中,牛肉膏,为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，,蛋白胨,主要提供氮源和维生素，而,NaCl,提供无机盐。,由于这种培养基多用于培养细菌，因此要用稀酸或稀碱将其,pH,调至,中性或微碱性,(7.0-7.2),，以利于细菌的生长繁殖。,3.,溶化：,先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加自来水定溶至,100mL,。,4.,灭菌：,将配制好的培养基放到锥形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），连同培养皿（,3,5,套，用几层报纸包好）一起放到高压锅内灭菌。,5.,倒平板：,待培养基冷却到,50,左右时倒平板（如教材,17,图示）。,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基,倒平板操作的讨论,(,课本,P,17,),1.,培养基灭菌后要冷却到,50,O,C,时倒平板。用什么办法来估计培养基的温度？,用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手时即可开始倒平板。,2.,为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？,通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。,3.,平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，,又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,4.,在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此,最好不要用,这个平板培养微生物。,（二）纯化大肠杆菌,微生物接种方法常见的有,平板划线法,和,稀释涂布平板法,。,1.,平板划线法,通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面（操作如教材,18,页图示）。,在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体称,菌落,。,1,、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；,每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种,使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端,从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。,划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,平板划线法的讨论,2.,在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？,以免接种环温度太高，杀死菌种。,3.,在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,2.,稀释涂布平板法,将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养。,在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。,稀释涂布平板法操作过程分两个步骤，即系列稀释操作和涂布平板操作。,系列稀释操作,10,1,10,2,10,3,10,4,10,5,10,6,(1),将分别盛有,9mL,水的试管灭菌并编号。,(2),用移液管吸取,1mL,培养的菌液，注入第二支试管中，轻压橡皮头，吹吸三次使之充分混匀。,(3),从,10,1,倍稀释的试管中吸取,1mL,稀释液，注入第三支试管中，重复步骤,2,，直至到第六支试管。,涂布平板操作,(1),将涂布器浸在盛有,70,的酒精的烧杯中。,(2),取少量菌液,(,不超,0.1mL),滴加到培养基表面,.,(3),将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却,8,10s,。,(4),用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。,涂布平板操作讨论,涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第,2,步应如何进行无菌操作？,应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。,将接种后和未接种（作为对照组）的培养基均放到,37,0,C,的恒温箱中，培养,12,24h,后进行观察并记录结果。,五、结果分析与评价,1.,未接种的培养基表面是否有菌落生长？如果有菌落生长，说明了什么？,未接种的培养基在恒温箱中保温,1,2 d,后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。,2.,在接种大肠杆菌的培养基上，能否观察到独立的菌落？它们的大小、形状、颜色相似？,如果接种成功的话，在培养基的表面可观察到大小、形状、颜色相似的菌落。,3.,培养,12h,和,24h,后，观察到的实验结果相同吗？如果不同，请分析产生差异的原因？,培养,12 h,与,24 h,后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同。随着时间的延长、菌落的不断生长，使菌落不断增大。,4.,如果在培养基上观察到不同形态的菌落，请分析其可能的原因。,无菌操作未达到要求：,可能是培养基灭菌不彻底；,可能是接种时发生了污染；,也可能是在培养的过程中受到了污染。,六、课题延伸,菌种的保存,1.,试管低温临时保存,将菌种接种到试管的固体斜面培养基上，培养成菌落后，置于,4,O,C,的冰箱中保存（每隔,3,6,个月要重新接种培养后再保存）。,2.,甘油管长期保存,在,3mL,的甘油瓶中加入,1mL,的甘油，高压灭菌。将,1mL,培养的菌液转移到甘油瓶中，充分混合后，置于,20,O,C,的冷冻箱中保存。,本课题知识小结,:,课后练习,1.,提示：可以从,微生物生长需要哪些条件,的角度来思考。例如，微生物的生长需要水、空气、适宜的温度，食品保存可以通过保持干燥、真空的条件，以及冷藏等方法来阻止微生物的生长。,2.,提示：可以从这三种培养技术的,原理、操作步骤,等方面分别进行总结归纳。例如，这三种培养技术都需要为培养物提供充足的营养，但无土栽培技术的操作并不需要保证无菌的条件，而其他两种技术都要求严格的无菌条件。,