外周血单个核细胞分离

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,外周血单个核细胞的分离及活力测定,Isolation and storage of PBMC and viability test,实验原理,人外周血单个核细胞,（,peripheral blood mononuclear cell,，,PBMC,）,包括淋巴细胞和单核细胞。,单个核细胞的体积、形态和比重与外周血其他细胞不同。因此利用一种介于,1.075-1.090,之间的聚蔗糖,-,泛影葡胺,（,ficoll-hypaque,）,分离液作密度梯度离心，,离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,从而分离出,PBMC,。,人血液中各种细胞的密度如下：,红细胞：,1.093,白细胞：,1.092,淋巴细胞和单核细胞：,1.075-1.090,血小板：,1.030-1.035,F/H= 1.0770.001,肝素抗凝全血,+,等量,Hanks,液,将,F/H,管稍倾斜,将稀释血液在距分层液界面上,1 cm,处沿试管壁缓慢加至分层液上面。,应注意保持两界面清晰，勿使血液混入分层液内。,Ficoll/Hypaque,(2:1),1500rpm, 20 min,水平离心,血小板, 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。, 简述补体的经典激活途径的具体过程。, 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将,几种成分反应顺序颠倒，结果会如何,？, 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预,先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？,用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。,将所得到的,PBMC,悬液用,5,倍体积的,Hanks,液或,RPMI-l640,洗涤,2,次，,1500 rpm 5min,。,淋巴细胞浓度（细胞数,/ml,）,=,四个大方格内细胞数,/410,4,细胞计数板,计数细胞,调整细胞至所需浓度,台盼蓝染色测定细胞存活率,台盼蓝（,trypan,blue,）染色法是测定细胞活力的最简便的方法。,台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故,活细胞不着色,，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使,死细胞着色呈蓝色,。,细胞存活率,(%),无色细胞数,/,细胞总数,100%,计数,200,个细胞，一般活性应在,95,以上,注意事项,1.,与血液样品接触时应注意安全防护，避免血源性传染病传染。,2.,操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。,3.,细胞分层液在室温下比重为,l.0770.001g/L,；应避光,4 ,下保存，取出后逐渐升至室温后混匀，方可使用。使用中应避免细菌污染。,4.,稀释血液可降低红细胞的凝集，提高淋巴细胞收获量，但如果要保留血浆成分作其他实验用时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。,E,玫瑰花环试验,Erythrocyte rosette formation test,原理,T,淋巴细胞,表面有,绵羊红细胞,受体（,CD2,），不需要任何处理可与绵羊红细胞结合形成花环，,B,淋巴细胞和巨噬细胞无绵羊红细胞受体，因此形成,E,花环的细胞主要是,T,淋巴细胞。,计算外周血中,E,花环形成细胞的百分率，可从数量大致推测机体的细胞免疫状态。,原理,T cells,SRBC,E- rosette,E,玫瑰花环试验,高倍镜下计数,200,个以上的淋巴细胞中花环形成细胞的百分数。,凡能结合三个以上,SRBC,者为花环形成细胞。,正常值：,60-80%,淋巴细胞功能检测,淋巴细胞转化试验,Detection of lymphocyte function,：,lymphocyte transformation test,原理,指体外培养的淋巴细胞与特异性抗原或非特异性促有丝分裂物质如植物血凝素（,PHA,）等接触后发生胚变（或返祖）现象，转化为淋巴母细胞的一种方法。,淋巴细胞在抗原或促有丝分裂原的刺激下淋巴细胞的,DNA,合成而分裂增殖，并在细胞形态上也向母细胞转化，因此通过形态学观察或同位素掺入法可测得细胞分裂增殖的程度，从而判断淋巴细胞对有关刺激物的反应及其功能，以此了解机体的细胞免疫状态。,转化的淋巴细胞,未转化的淋巴细胞,意义,由转化率的高低可以了解,人体免疫功能状况,。,正常人淋巴细胞转化率为,50,70%,，故此试验可作为某此疾病诊断和治疗的参考。,