石蜡包埋组织的DNA提取及影响因素

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,福尔马林固定石蜡包埋组织DNA的提取及影响因素,2012.12,娄全博,现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类的疾病研究，为了解病理状态下基因组,DNA,的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和,DNA,甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展等方面均具有重要意义。,医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位,PCR,分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对,DNA,或,mRNA,分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。,Goelz(1985),成功地从蜡块中提取出高质量的,DNA,，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了,DNA,研究依赖于新鲜或冰冻组织细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。,石蜡包埋组织,DNA,提取的流程图,组织包埋,组织固定,取材,切片,脱蜡,消化,提纯,组织包埋制作过程中的影响因素,1.1,福尔马林固定,福尔马林固定液的主要成分：甲醛是最小的含氧有机物，具有较高的反应活性，可以和带有,-OH,（羟基）、,-SH,（巯基）、,-NH2,（氨基）的分子发生亲核加成反应，最终作为亚甲基,(-CH2-),的提供者，与上述基团中的两个基团反应，使自由的分子链被交联起来，从而发挥对组织固定的作用，同时也对,DNA,分子产生不利的影响。最早表现为,DNA,分子呈可逆性亚氨基和氨基的羟甲基化，随固定时间延长，生物大分子之间缓慢形成广泛的亚甲基交联桥，导致,DNA,链的脆性增加，在受到剪切力作用时，更容易发生随机断裂,1,。,甲醛介导的,DNA,损伤，在固定,3h,后已发生。固定时间越长，甲醛所致,DNA,损伤越严重，越不易从中获得大片段,DNA,。相关文献记载固定时间分别为,3,、,7,、,16,、,32d,且保存,15,年的包埋组织进行研究的结果显示，固定,16d,可成功获取,250bp,左右的,DNA,片段，固定,32d,则仅能获取,100bp,左右,DNA,片段,2,。甲醛除本身可造成,DNA,分子损伤外，其与氧化性物质接触后形成的甲酸，可改变环境,pH,，从而影响,DNA,分子稳定性，使核酸中嘌呤基的,糖苷键容易发生水解而导致,DNA,链断裂,3,。实验证明，中性缓冲型福尔马林固定剂能有效中和甲醛氧化生成的甲酸，使环境,pH,得以稳定，在所提取,DNA,的质和量上都明显优于其他固定剂。,1.2,浸蜡与包埋,用于组织包埋的固体石蜡为多种烃烷混合物，溶程为,50,65,，其化学性质稳定，在通常条件下不与酸性（除硝酸外）和碱性溶液发生作用。迄今尚无石蜡能直接导致包埋组织中,DNA,降解的报道。但有文献记载，在石蜡包埋过程中,DNA,更容易发生降解。其可能的机制是组织浸蜡与包埋时需要加热到,62,左右，此时,DNA,部分解链，组织内残留的痕量甲醛可对解链后的,DNA,单链进行甲基化修饰，修饰后的,DNA,单链在冷却后不易复性而导致的降解,4,。另外，石蜡可阻碍消化液对组织的渗透，从而抑制蛋白酶,K,与组织内蛋白的接触，影响组织消化和,DNA,释放。在,DNA,提取过程中，如未能有效去除石蜡，形成的,DNA-,石蜡混合液，不利于,PCR,扩增,5,。,1.3,切片规格,为保证包埋组织中提取的,DNA,量能够满足后续检验的需求，可通过增加切片厚度或增加切片的张数来实现。但切片过厚不利于组织脱蜡和蛋白酶消化，而切片过薄易造成,DNA,的机械损伤，同时切片总面积的增加，其表面黏附的,PCR,抑制因子将可能增多,6,。文献中对比观察切片厚度为,2.5m,、,5.0m,和,10.0m,三种情况下进行二甲苯脱蜡后，有机溶剂法提取,DNA,的质量差异。三者比较，,10.0m,切片,DNA,质量最好，,2.5m,切片提取的,DNA,在,PCR,扩增后电泳，虽可见目的基因条带，但条带较淡，目的基因测序图混乱，难以读出碱基序列，效果远不如其他两种情况,7,。,DNA提取的预处理脱蜡,为消除石蜡对,DNA,提取和,PCR,扩增的不良影响，必须在保证不增加外源性,PCR,抑制因子的和尽量减少,DNA,额外损伤的前提下对组织进行彻底地脱蜡，这是与其他生物性检材提取,DNA,过程的最大不同点。,2.1,有机溶剂脱蜡法,二甲苯是被常用于包埋组织脱蜡的高效有机溶剂。首先将石蜡包埋的组织浸泡在二甲苯溶液中于室温下脱蜡，一般进行两次，分别为,2h,和,12h,。然后用梯度乙醇,(100%,至,70%),复水，使组织结构疏松,利于消化液渗入，同时去除组织中痕量的二甲苯和甲醛。待乙醇自然挥发后将组织浸泡于消化缓冲液。根据需要，可适当提高二甲苯脱蜡的温度,(48,或,65),、增加脱蜡的次数、延长脱蜡或复水时间等。该法脱蜡比较彻底，利于组织消化，但是过多的操作步骤增加了,DNA,受污染的可能，亦容易人为地造成,DNA,机械性损伤，并且需要接触有毒物质二甲苯。,2.2,加热脱蜡法,通过加热使石蜡溶解，继而从组织中分离出来的方法，比较省时省力，同时也避免了接触有毒化学试剂。但,DNA,受热后不稳定，组织内释放出的一些金属离子以及核酸酶等易对其造成损伤，加热温度越高时间越长，,DNA,受损则越严重。另外,组织受热不均,脱蜡有不彻底的可能。,2.2.1,水浴加热脱蜡法,将组织样本浸泡于生理盐水中，在接近石蜡熔点的温度（,65,）下水浴，重复,1,次,2,次，可达到去除石蜡的目的。有研究表明，水浴加热时间与大片段,DNA,检出率成反比,建议采用,65,水浴,10 min,效果较好,8,。也有研究提出用,TES,液（,10 mmol Tris-HCl,、,1 mmol EDTA,、,0.5% SDS,）代替生理盐水进行水浴加热脱蜡,能有效提高,DNA,的产量和质量,9,。,2.2.2,微波加热脱蜡法,将装有组织切片的离心管中加入消化缓冲液,(50 mmol/L Tris,，,1 mmol/L EDTA,，,0.5% Tween20 pH 8.5),，密封后，置于微波炉中加热,2min,（时间长短视石蜡而定），利用电磁波的穿透力，对组织进行深层加热，可在短时间内对组织进行比较彻底地脱蜡,10,。该法与传统的二甲苯脱蜡法相比，具有高产量提取，高效率扩增的优势，而且具有操作简单、实验消耗少、污染危险性小等优点，是一种值得提倡的方法。,包埋组织中DNA提取的注意事项,3.1 蛋白酶K的消化作用,3.1.1酶浓度,适当地增加蛋白酶K浓度和延长消化时间将有利于组织消化和DNA的释放。通过比较不同浓度蛋白酶,K,（,0.5,mg/mL,，,1.0,mg/mL和4.0 mg/mL,）,对,包埋组织,的消化效果后发现，消化液中蛋白酶K浓度越高，消化时间越长获取的DNA量越多。然而，随着蛋白酶K浓度的升高，提取的DNA数量虽然增多，但质量反而有所下降，对较大DNA 片段（大于200bp,）,进行PCR扩增的成功率也下降，其原因不明,1,1,。,3.1.2,消化温度,蛋白酶,K,的最佳工作温度是,56,温度过低不利于发挥蛋白酶,K,活性，过高则不利于保护,DNA,的完整性，故新鲜组织与冰冻组织通常选择,37,下消化过夜。研究表明,37,和,56,两个温度下蛋白酶,K,消化包埋组织的效果进行了比较，发现,56,消化不仅可获得较多量的,DNA,，而且可产生高质量的,DNA,12,。,3.1.3,消化缓冲液的离子强度,在高离子强度的环境下，生物大分子链趋于高度螺旋收缩状态，因此，甲醛介导的,DNA,与核蛋白之间的交联结构，在中、高离子强度下将得以稳定存在。反之，采用低离子强度的消化缓冲液将利于舒展其分子结构，从而促进蛋白酶的消化作用。,3.2,选择合适的,DNA,提取方法,DNA,分子因受甲醛作用脆性增加，受机械剪切力作用后容易发生断裂。因此，提取,DNA,过程中，应当避免剧烈振荡和过高的温度，尽量减少提取过程中的操作步骤，以减少对,DNA,分子的额外损伤。包埋组织中,DNA,提取方法主要分为两类。一类是基于蛋白酶,K,消化的,DNA,提取方法,其中有机溶剂法提取的,DNA,在纯度上有着明显的优越性，但其实验过程中需多次移管、震摇和离心操作，既容易加重,DNA,的机械损伤，又容易导致外来,PCR,抑制物的污染。,氯化钠盐析法是通过在包埋组织经蛋白酶,K,消化后的溶液中加入高浓度盐溶液（等体积,3 mol/L,的,NaCl,溶液），破坏蛋白质在水中的稳定性因素而达到沉淀的目的，其实验过程简便快捷、造价低廉、无须接触有毒化学试剂，而,DNA,产量和,PCR,分型成功率与前者效果相当。,另一类是基于水煮加热的一步提取法，在水煮液中加入终浓度,10%,的,Chelex-100,或终浓度,1%,的,Triton,x,-100,。,Chelex-100,是一种由聚乙烯乙二烯苯组成的螯合基团，能螯合包埋组织在高温裂解后释放的内源性二价金属离子，如,Mg,2+,、,Ca,2+,等,从而阻止其在高温下与断裂,DNA,的作用,; Triton,x,-100,则是一种强的非离子表面活性剂，能促进蛋白成份变性溶解。,3.3,去除,PCR,抑制因子,包埋组织提取,DNA,中存在着一些不能通过蛋白酶,K,消化和有机萃取法去除的,PCR,反应抑制因子，随包埋组织取量的增加,其抑制效果越明显,13,。例如，包埋组织中,DNA,严重降解后出现的大量寡核苷酸碎片，在,PCR,扩增时，可竞争性结合反应体系中的,Mg,2+,，降低,Mg,2+,的有效浓度，从而降低,DNA聚合酶,酶的活性，同时还可干扰引物与模板的结合而降低,PCR,扩增效率。采用凝胶层析技术可以有效地去除寡核苷酸片段的影响,总而言之，包埋组织中,DNA,的提取和,PCR,的扩增比较困难，影响因素颇多，研究还不是十分透彻。上述各种方法虽各具针对性，但是基于效率、卫生、经济，尤其实验稳定性的考虑，都不很理想。对于包埋组织中客观存在的,PCR,扩增抑制因子的研究并不明朗，,300bp,以上,DNA,片段的提取和,PCR,扩增的成功率非常低, 500bp,以上片段的成功率则是偶有报道,12,，这很难满足医学科研需要。因此，建立一种实用、有效的从包埋组织中提取,DNA,的方法，合理调整制定,PCR,扩增对策等问题,还将有待进一步深入的研究。,参考文献,1 Mies C, Houldsworth J, Chaganti RS. 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