第9章白细胞血型课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,*,*,*,白 细 胞 血 型,第 九 章,1,白细胞抗原,1,、,红细胞血型抗原：如,A,、,B,、,H,、,Le,a,、,Le,b,等。,2,、,白细胞特有抗原：,如,CD4,、,CD8,等。,3,、,人类白细胞抗原,（,human,leucocyte,antigen,，,HLA,）：,与其它组织细胞共有的抗原,。,首先在白细胞表面被发现,白细胞表面含量最高,白细胞是研究这种抗原的最好材料,2,HLA,研究简史,1958,年，,Dausset,确立了人类第一个白细胞抗原,Mac,，即现,在所称的,HLA-A2,抗原，标志着,HLA,研究的开始。,1958,年，,Payne,和,van Rood,各自分别发现某些经产妇血清,中含白细胞抗体，抗体发生率随妊娠次数增加而,增加，为寻找白细胞抗体提供了一条有效途径。,3,1962,年，,Janvan,Rood,用统计学方法，借助电子计算机分,析白细胞抗血清的特异性，发现,4a/4b,双等位基,因，即现在的,Bw4,和,Bw6,抗原；,之后，补体依赖的细胞毒试验被引人白细胞抗原,检测，,Terasaki,又将这一技术微量化，建立了微,量淋巴细胞毒试验。,HLA,研究简史,4,1964,年,英国学者,Walter,Bodmer,报告了,LA1,、,LA2,和,LA3,，,即,HLA-A1,、,A2,和,A3,抗原，奠定了,HLA,分型的基础,;,在,Walter,Bodmer,和,Julie,Bodmer,的努力之下，国,际主要组织相容性工作小组和国际组织相容性工作,讨论会应运而生,;,召开了第一届“国际组织相容性工作讨论会”,;,NIH,成立,HLA,血清库，开展国际间的,HLA,抗血清交换。,HLA,研究简史,5,届数,年份,主 要 内 容,第一届,1964,年,世界各国实验室互相交换试剂，共同分析实验结果，统一方法与命名，,Terasaki,建立微量淋巴细胞毒试验作为白细胞分型技术,第二届,1965,年,确认了,HLA,是人类组织相容性抗原；开始研究白细胞配型与皮肤、肾移植的关系,第三届,1967,年,检出了,6,个白细胞抗原，开始了,HLA,与疾病的关联性研究；世界卫生组织正式使用,HL-A,命名；临床证明,HLA,配型能改善移植器官的存活,第四届,1970,年,证实了,HLA-A,、,B,座位的存在，检出,21,种,HLA,特异性,第五届,1972,年,研究了,HLA,的群体遗传学，确定,HLA,由两条多肽链组成，,HLA,复合物位于人类第,6,号染色体上,第六届,1975,年,确定了,HLA-C,和,HLA-D,座位，用血清学方法检出,B,细胞抗原,历届国际组织相容性抗原研讨会主要内容,6,第七届,1977,年,确定了,HLA-DR,座位,第八届,1980,年,确定了,92,种,HLA,抗原，分别位于,HLA-A.B.C.D,和,DR,等,5,个座位，开始接受单克隆,HLA,抗体,第九届,1984,年,确定了,124,种,HLA,抗原，及,HLA-DP.DQ,座位,第十届,1987,年,确定了,135,种,HLA,抗原，开始建立,HLA,类的分子生物学分型技术,第十一届,1991,年,确定了,146,种,HLA,抗原，建立了,HLA II,类的,PCR-SSCP,分型标准，并明确今后凡确定新的血清学特异性，均需有,DNA,序列分析及氨基酸序列分析的资料,第十二届,1996,年,研究,HLA,在,DNA,水平的变异及其免疫学功能，建立了,HLA I,类分子生物学分型方法,(,续表,),7,1999,年,在人类基因组计划工作草图完成之际,国际,MHC,测序协作小组在著名,Nature,杂志上公布了人类,MHC,基因参考序列图。,HLA,研究简史,8,(,续表,),届数,年份,主 要 内 容,第十三届,2002,年,进一步研究,HLA,在,DNA,水平的变异及其生物学功能，建立了标准化,HLA DNA,测序的分型方法,第十四届,2005,年,讨论,HLA,在人类学及相关疾病领域中的应用,第十五届,2008,年,探讨,HLA,在造血细胞移植中的作用与意义,国际主要组织相容性工作小组,（,International,Histocompatibility,Working Group,，,IHWG,）,http:/,www.ihwg.org,9,HLA,是人的,主要组织相容性抗原,在不同种属或同种不同系的动物个体间进行正常组织或肿瘤移植会出现排斥，它是供者与受者组织不相容的反映。排斥反应是一种免疫反应，是由细胞表面的同种异型抗原诱导的。,移植抗原或组织相容性抗原：,代表个体特异性的同种抗原。,主要组织相容性抗原：,在组织相容性抗原中，能引起强而,迅速排斥反应的抗原,。,HLA,抗原,10,HLA,抗原有两类：,HLA-,类抗原和,HLA-,类抗原。,HLA,抗原,11,HLA,抗原有两类：,HLA-,类抗原和,HLA-,类抗原。,HLA,抗原,存在于细胞表面,跨膜蛋白质，,异二聚体蛋白,三级结构的相似之处：抗原结合部位均由,8,条反向平行的,折叠链和,2,条反向平行的,螺旋链组成，称为肽结合槽,具有多态性的氨基酸残基位于此槽的底部。,12,HLA,抗原,用一些物理或化学方法，如酶、去污剂、超声波可使,HLA,抗原与细胞膜分离，溶解在水溶剂中。,HLA,抗原一旦从细胞膜上除去后，活细胞会在,6,个小时内重新合成这些抗原。,13,HLA,抗原,凡能使蛋白质变性的理化因素都会使,HLA,抗原发生不可逆的变性，如,50%,尿素、,90%,酚、酒精、热、,pH,4,或,pH,9,，以及有机溶剂等。,HLA,的抗原活性受机体生理周期，病理变化，激素水平改变以及使用某些药物的影响而变化。,14,分布,HLA-,类抗原,几乎存在于所有的有核细胞表面，,不同细胞上的抗原分子多寡不同：,以淋巴细胞上的密度最高；正常情况下，心肌细胞和肝细胞,HLA,抗原极少或没有。,15,分布,HLA-,类抗原,成熟红细胞上没有,HLA-A,、,B,、,C,，幼稚红细胞却有，年轻红细胞上有少量,HLA,抗原。,血浆中有可溶性,HLA-,类抗原，可能是细胞膜代谢所致。,血小板除自身带有,HLA-,类抗原外，还可以从血浆中吸附可溶性,HLA,抗原。,16,结构：,由重链和轻链两条多肽链构成，以非共价键相连接 。,重链（,链）,: HLA ,类,DNA,分子编码,350,个氨基酸，,45KD,3,个,含,90,个氨基酸的,结构域,1,2,3,3,很恒定，,2,和,1,有高度多态性,轻链（,m,）：,2,微球蛋白,编码基因位于,15,号染色体上,约由,100,个氨基酸组成，无多态性,HLA-,类抗原,17,HLA-I,类抗原可分为四个区：,HLA-,类抗原,氨基端胞外多肽结合区,胞外免疫球蛋白样区,胯膜区,胞浆区,18,氨基端胞外多肽结合区,：,1,和,2,。,氨基酸序列呈螺旋状排列，形成凹槽，为抗原,决定槽,。,类抗原中的抗原决定槽两端是封闭的，只能容纳、提呈,89,个氨基酸的短肽。,决定,HLA-I,类抗原多态性的所有氨基酸也都位于凹槽边或底部。,HLA-I,类抗原可分为四个区：,HLA-,类抗原,19,HLA-,类分子抗原结合区的三维图,20,胞外免疫球蛋白样区,：,3,和,Bm,。,3,很恒定，与免疫球蛋白的恒定区具有同源性。,Bm,游离在细胞外，与,1,、,2,和,3,的相互作用对维持,类抗原分子天然构型的稳定性有重要意义。,胯膜区,：氨基酸残基形成螺旋状穿过浆膜的脂质双层，将,类抗原分子固定在膜上。,胞浆区,：位于胞浆中，可能与细胞内外的信号传递有关系。,HLA-I,类抗原可分为四个区：,HLA-,类抗原,21,肽,结合区,免疫球蛋白样区,跨膜区,胞浆区,HLA-I,类抗原,结构示意图,1,2,3,22,分布,HLA-,类抗原的分布远不如,I,类抗原广泛，主要分布于单核细胞，树突状细胞等具有吞噬功能的细胞、以及,B,细胞、活化,T,细胞、肿瘤细胞等。大多数骨髓分化细胞也具有,HLA,-,类抗原。,HLA-,类抗原,23,结构：,由,和,两条链构成，以非共价键连接。,HLA-,类抗原,链：分子量为,33,35Kd,HLA-,类基因编码,2,个结构域，,1,与,2,链：分子量为,25,30Kd,HLA-,类基因编码,2,个结构域，,1,与,2,24,结构,HLA-,类抗原,类抗原的多态性是由结构域,1,和,1,所决定。,HLA,类抗原分子中的抗原决定槽两端是开放的。因此，,类抗原分子能够容纳、提呈,1524,个氨基酸的长肽。,25,HLA-II,类分子抗原结合区的三维图,26,肽,结合区,免疫球蛋白样区,跨膜区,胞浆区,HLA-,类抗原,结构示意图,2,1,2,1,27,HLA,基因,编码主要组织相容性抗原的基因位于同一染色体片段上，形成一组紧密连锁的基因群，称为,主要组织相容性复合体,所有研究过的脊椎动物中都存在结构与功能相似的,MHC,遗传区域。,小鼠：,H-2,；猪：,SLA,；人：,HLA,系统,28,HLA,基因位于人,6p21.31,。,参考序列,长,3600kb,，,占整个人类基因组全部碱基序列的,0.12%,。,是一个由一系列紧密连锁的基因座所组成的复合遗传系统,。,HLA,基因,29,HLA,区域内的基因座根据其编码,HLA,分子的分布、多态性与功能不同分为三个区,：,HLA-,类基因区：,约,16002000kb,，在复合体中位于远离着,丝点的一端，产物是,HLA-I,类抗原分子。,HLA-,类基因区：,约,10001200kb,，在复合体中位于近着丝,点一端，其产物是,HLA-II,类抗原分子。,HLA-,类基因区：,居中，约,4001000kb,，产物为补体成分、,细胞因子等。,HLA,基因,30,31,HLA-I,类基因区,经典,HLA-I,类基因,(classical class I gene, HLA,Ia,),非经典,HLA-I,类基因,(non-classical class I gene, HLA-,Ib,),MIC,基因,假基因,32,经典,HLA-I,类基因,经典,HLA -I,类基因是指三个最早发现的功能位点,HLA-A,HLA-B,和,HLA-C.,HLA-,Ia,基因均具有高度多态性。,HLA-A HLA-B HLA-C,等位基因数量（,2000,年）,207 412 100,每个等位基因均编码经典,I,类抗原分子的重链。,33,非经典,HLA-I,类基因,包括,HLA-E,、,F,、,G,位点,HLA-,Ib,基因,多态性有限,编码产物分布局限,34,HLA-E,基因,已命名的等位基因有,6,个。,细胞膜表面低表达,HLA-E,分子,但在胎盘滋养层有较高表达。, HLA-E,分子是,NK,细胞抑制性受体,CD94/NKG2,的特异性配体，在免疫调节中起重要作用。,非经典,HLA-I,类基因,35,HLA-G,基因,基因结构与,HLA-,Ia,相似,已被正式命名的等位基因,14,个。,仅表达于与母体组织直接接触的胎儿滋养层细胞上,而这些细胞不表达经典的,I,类与,类抗原。, HLA-G,分子可能是,NK,细胞抑制性受体,KIRZDL4,的配体,在母胎耐受中起重要作用。,非经典,HLA-I,类基因,36,MIC,基因（,HLA-I,相关基因）,五个基因：,A,、,B,、,C,、,D,、,E,MICA,和,MICB,为功能基因,MIC C, MIC D, MIC E,为假基因,MICA,基因,具有高度多态性（,51,个等位基因）,与,HLA-B,基因之间存在高度连锁不平衡。,MICA,分子是,NK,细胞抑制性受体,NKG2D,的配体。,37,主要位于,HLA-A,基因附近,因有突变而没有产物表达,假基因,38,HLA-II,类基因区,经典,HLA-II,类基因：,DR,、,DQ,、,DP,非经典,HLA-II,类基因：,DM,，,DO,TAP,LMP,39,DR,1,个,DRA,基因,+9,个,DRB,基因（,DRB1,DRB,9,）,DRB1,是,II,类区域中多态性最丰富的基因,(,等位基因,:271,个,),DRA,基因编码,DR,分子重链,（,链,），,DRB,基因编码,DR,分子的,链,与,DRA,编码的,链共同组成由血清学方法检出的,DRI,一,DR18,抗原特异性。,经典,HLA-II,类基因,40,不同,DR,单倍型中,DRB,基因的排列组合,B,基因含有几种不同的基因重排。,DRB,区域的结构和长度在不同的单倍型中有所不同。,经典,HLA-II,类基因,41,DQ,两对,DQA,、,DQB,基因：,DQA1,和,DQA2,、,DQB1,和,DQB2,DQA1,和,DQB1,为功能基因，编码,DQ,链和,DQ,链，构成,DQ,分子；,DQA1,和,DQB1,具有高度多态性：已被正式命名的,DQA1,等位基因有,20,个, DQB1,等位基因,45,个 。,DQA2,、,DQB2,为假基因，无表达产物,经典,HLA-II,类基因,42,DP,有两对,DPA,、,DPB,基因。,DPA1,、,DPB1,为功能基因，编码,DP,分子的,、,链,。,DPA2,和,DPB2,为假基因,无产物表达。,经典,HLA-II,类基因,43,非,经典,HLA-II,类基因,DM,含,2,个,DM,基因，即,DMA,、,DMB,DMA,基因和,DMB,基因具有多态性,（,DMA,：,4,个等位基因，,DMB,：,6,个等位基因）。,DM,编码的蛋白分子与,DR,分子结构相似,DM,分子在外源性抗原递呈中起重要作用,44,LMP,LMP2,基因和,LMP7,基因,编码低分子量多肽（,LMP,）,LMP,将被处理的内源性蛋白质切割成小片段的肽，供,HLA,分子结合。,非经典,HLA-II,类基因,45,TAP1,基因和,TAP2,基因,TAP,基因具多态性,编码抗原肽转运子（,transporter associated with antigen processing,，,TAP,），,TAP,分子属,ABC,转运体,超家族成员，主要功能是将,LMP,酶解后的内源性抗原肽选择性的转运到内质网中，与新合成的,I,类分子结合。,TAP,非经典,HLA-II,类基因,46,HLA-III,类基因区,人类基因组中基因密度最大的区域,补体基因,C2,、,C4,、,Bf,TNF,、,LTA,、,LTB,基因,21-,羟化酶基因,热休克蛋白基因：,47,HLA,基因定位与基因结构,48,DPw1 DQ2 DR1 B5 Cw1,A1,DPw2 DQ3 DR3 B7 Cw2,A2,DPw3 DQ7 B8 Cw3,A3,II,类区,2,m,第,15,号染色体,B C A,HLA,抗原表达,HLA,基因,I,类区,49,多态性,50,HLA-A,697,HLA-DRA,3,HLA-B,1109,HLA-DRB1,603,HLA-C,381,HLA-DRB29,87,HLA-E,9,HLA-DQA1,34,HLA-F,21,HLA-DQB1,95,HLA-G,36,HLA-DPA1,27,MICA,65,HLA-DPB1,131,MICB,30,HLA-DMA,4,HLA-DMB,7,HLA-DOA,12,HLA-DOB,9,类合计,2348,类合计,1012,WHO,命名委员会正式命名的,HLA,等位基因数,(2008,年,7,月,),51,多态性,在,HLA,区的每个基因座位上都有许多等位基因，等位基因之间的差别是由于核苷酸替换产生。,核苷酸的替换在,DNA,水平上产生了单碱基多态性，可对应地导致蛋白质氨基酸序列中氨基酸替换，产生独立的抗原特异性。,一些等位基因，由于其核苷酸的替换产生的蛋白质氨基酸序列未变或改变并未明显影响到蛋白质抗原表位结构，未产生新的抗原特异性。,52,HLA,系统多态性的意义,多态性,保证了机体对各种病原体产生合适的免疫反应以维持机体稳定性，对维持种属的生存和延续具有重要的生物学意义。,HLA,系统成为一个极好的人类遗传学标记。,给组织移植过程中寻找配型合适的供体带来很大的困难。,53,HLA,基因,基因密度最高的区域，在,3.6Mb,区域内共确认了,224,个基因,平均,16kb,一个基因；,免疫功能相关基因最密集、最多的一个区域，,128,个功能基因中,39.8%,的基因产物具有免疫功能；,多态性最丰富的区域；,54,世界卫生组织对,HLA,的命名包括基因命名与抗原特异性命名两个方面。,HLA,遗传区域中的座位,:,以大写字母表示,如,A,、,B,、,C,、,DR,、,DP,、,DQ,HLA,命名,55,抗原特异性：,HLA,命名,用数字表示,HLA-A,、,B,基因座上的抗原以发现先后秩序排列，因此,HLA-A,、,B,座位上的抗原特异性编号不重叠。,例如, A,：,1,、,2,、,3,、,9,、,10,、,11,等，,B: 5,、,7,、,8,、,11,、,13,等。,其他座位上的抗原特异性编号从,1,开始。,为防止与补体组分命名相混淆，,HLA-C,抗原特异性以,Cw,为字首命名。,56,抗原特异性：,HLA,命名,随着对,HLA,抗原研究的深入，,HLA,命名在不断修改。,一些原来命名的抗原特异性可被进一步细分。,先前命名的特异性称为,宽特异性,，分解后的抗原称为,窄特异性或亚型,。原来的宽特异性用括弧注明。,例如：,HLA-A23,（,9,）和,HLA-A24,（,9,）,HLA-B60,（,40,）和,HLA-B61,（,40,）,57,抗原特异性：,HLA,命名,抗原特异性不断在被合并,HLA ,类基因座,HLA ,类基因座,类抗原,类等位基因,类抗原,类等位基因,91,年,96,118,39,148,95,年,75,213,33,256,58,基因,HLA,命名,HLA,基因命名一般以,4,位数字表示,前,2,位,数字表示对应最相近的,HLA,抗原特异性，,后,2,位,数字则用于表示亚型的等位基因。,如：,A*0101,和,A*0102,，均表示能用血清学方法检出的,A1,抗原的等位基因，但它们,DNA,编码的序列不同，产物的,HLA,特异性存在细微差别。,59,基因,HLA,命名,如果出现第,5,位数字，则代表“沉默取代”，即该基因中虽发生了个别碱基的替换，但新密码子与原密码子属简并密码，不影响所编码的氨基酸序列。,如：,A* 31011,与,A*31012,，二者,DNA,序列不同，但编码的,A31,抗原的氨基酸序列均相同。,第,6,、,7,位数字代表相应的启动子,(,包括内含子或侧翼区等,),序列的多态性，如,DRB4*0101102,。,60,基因,HLA,命名,末尾加英文字母,N,表示无效等位基因或不表达基因。,如,DR B4*0101102N,在不能区分等位基因时，可允许取最前面的,2,位或,4,位数字表示该,HLA,的特异性。,如目前已检出,17,个,A2,等位基因，如果不能确定是哪个等位墓因，则可写作,A*02,；,61,HLA,的遗传,HLA,属常染色体共显性遗传,人类,HLA,每个基因座上有众多等位基因，故多数个体是,HLA,杂合子。,每个,HLA,基因座的两个等位基因表达一对抗原，组成了个体该基因座的表型。例如,HLA-A1,，,2,。,共显性遗传,62,表型,HLA-A1,2,；,B5,7,；,Cw1,2,；,DR1,3,；,DQ2,3,；,DP1,2,单倍型,HLA-A1,，,B5,，,Cw1,，,DR1,，,DQ2,，,DP1,基因型,HLA-A1, B5, Cw1, DR1, DQ2, DP1,/,A2, B7, Cw2, DR3, DQ3, DP2,HLA,的遗传,HLA,的表型和基因型,63,表型与基因型,HLA-A2, 11,；,B13, 44,A2, B13/A11, B44 A2, B44/A11, B13,HLA-A11, -,；,B13, 44,A11, B13/A11, B44 A11, B13/A-, B44 A-, B13/A11, B44,HLA-A11, -,；,B13, -,A11, B13/A11, B13 A11, B13/A-, B13 A11, B13/A11, B-,A11, B13/A-, B- A-, B13/A11, B-,HLA,的遗传,64,A2,30;B13,38 A11,24;B8,27,A2,A30,A2,A30,B13,B38,B38,B13,A11,A24,A11,A24,B8,B27,B27,B8,A2,A11,B13,B8,A2,A24,B13,B27,A30,A11,B38,B8,A2,11;B8,13,A2,24;B13,27,A30,A24,B38,B27,A11,30;B8,38,A24,30;B27,38,HLA,的遗传,65,A2,A30,A2,A30,B13,B38,B38,B13,A11,A24,A11,A24,B8,B27,B27,B8,A2,A11,B13,B27,A2,A24,B13,B8,A30,A11,B38,B27,A2,11;B13,27,A2,24;B8,13,A30,A24,B38,B8,A11,30;B27,38,A24,30;B8,38,HLA,的遗传,A2,30;B13,38 A11,24;B8,27,66,A2,A30,A2,A30,B13,B38,B38,B13,A11,A24,A11,A24,B8,B27,B27,B8,A2,A11,B38,B8,A2,A24,B38,B27,A30,A11,B13,B8,A2,11;B8,38,A2,24;B27,38,A30,A24,B13,B27,A11,30;B8,13,A24,30;B13,27,A2,30;B13,38 A11,24;B8,27,HLA,的遗传,67,A2,A30,A2,A30,B13,B38,B38,B13,A11,A24,A11,A24,B8,B27,B27,B8,A2,A11,B38,B27,A2,A24,B38,B8,A30,A11,B13,B27,A2,11;B27,38,A2,24;B8,38,A30,A24,B13,B8,A11,30;B13,27,A24,30;B8,13,HLA,的遗传,A2,30;B13,38 A11,24;B8,27,68,A2,11;B8,13,A2,24;B13,27,A11,30;B8,38,A24,30;B27,38,A2,11;B8,38,A2,24;B27,38,A11,30;B8,13,A24,30;B13,27,A2,11;B27,38,A2,24;B8,38,A11,30;B13,27,A24,30;B8,13,A2,11;B13,27,A2,24;B8,13,A11,30;B27,38,A24,30;B8,38,16,种理论表型,HLA,的遗传,69,单倍型（,haplotype,）,是指一条染色体上,HLA,各基因座的基因紧密连锁组成的基本遗传单位。,在,HLA,遗传过程中，单倍型作为一个完整的遗传单位由亲代传给子代。,单倍型遗传,HLA,的遗传,70,A11,Cw3,B27,DR5,A1,Cw2,B8,DR3,A2,Cw2,B44,DR9,A11,Cw3,B27,DR5,A2,Cw2,B44,DR9,A1,Cw2,B8,DR3,A24,Cw4,B51,DR2,A11,Cw3,B27,DR5,A24,Cw4,B51,DR2,A1,Cw2,B8,DR3,A2,Cw2,B44,DR9,A11,Cw3,B27,DR5,A24,Cw4,B44,DR2,子,1,子,2,子,3,子,4,子,5(,重组,),HLA,单倍型遗传图,A24,Cw4,B51,DR2,71,亲子之间一定共有一条单倍型,即,HLA,半相同。,同胞之间则存在三种情况,:,完全相同、,HLA,不相同及,HLA,半相同。,有,1/4,机会,HLA,单倍型完全相同；,有,1/4,机会,HLA,单倍型完全不同；,有,1/2,机会一半相同，即共有一个单倍型。,单倍型遗传,HLA,的遗传,72,1/4,1/4,1/4,1/4,半相同：,1/2,完全相同：,1/4,完全不相同：,1/4,73,74,连锁不平衡,处于,Hardy-Weinberg,平衡时，不同基因座的基因组成一个单倍型的频率等于各基因频率的乘积。,实际观察到的有些单倍型观察频率高于期望频率或低于期望频率，这种现象称为,连锁不平衡,（,linkage disequilibrium,）。,HLA,的遗传,75,如：,Al B8 Al-B8,0.12 0.17,预期,（,0. l2XO. 17,）,0.02,实际,0.09,连锁不平衡,HLA,的遗传,处于连锁不平衡状态说明,HLA,不同基因座的基因之间存在关联，具有一同遗传的趋向。,76,HLA,遗传特征,共显性遗传,单倍型遗传,连锁不平衡,HLA,的遗传,77,HLA,分型,血清学分型,：,微量淋巴细胞毒试验，主要用于检测,HLA-A,、,B,、,C,、,DR,和,DQ,基因座的抗原。,细胞学分型,：,淋巴细胞培养试验，主要检测,HLA-D,和,DP,基因座的抗原,DNA,分型,；可检测,HLA,所有等位基因,HLA,分型方法可归纳为,3,类：,78,或称补体依赖的细胞毒试验，首先由,Terasaki,在,1964,年建立，后经美国国立卫生研究院（,National Institute of Health, NIH,）标准化，故又称,NIH,技术。,血清学分型,微量淋巴细胞毒试验,79,分型原理,：淋巴细胞膜上的,HLA,抗原与已知,HLA,血清中相应抗体结合后，形成抗原抗体复合物，再结合补体。被激活的补体系统产生细胞毒性，攻击并破坏淋巴细胞。经过染色，染料进入破损细胞内着色，为阳性结果。如果抗原与抗体未结合成抗原抗体复合物，则不能结合补体，细胞膜完整，染料无法进入细胞内，为阴性结果。,血清学分型,微量淋巴细胞毒试验,80,步骤,血清学分型,1,淋巴细胞分离：,A,、,B,、,C,抗原检测用混合,T,、,B,淋巴细胞。,DQ,、,DR,抗原检测用,B,淋巴细胞。,2.,用,Terasaki,液调细胞浓度至,2.010,6,个,/ml,81,血清学分型,3,微量淋巴细胞毒试验,1,）冰箱取出,HLA,分型板及补体复温。,2,）于每孔中加,1l,细胞悬液混合，最后加阳性对照。,3,）若作,HLA-A,、,B,、,C,分型，在室温下卵育,30min,；若作,HLA-DR,、,DQ,分型，在室温孵育,60min,。,4,）加,5l,补体，混合。,5,）若作,HLA-A,、,B,、,C,分型，在室温下孵育,60min,；若作,HLA-DR,、,DQ,分型，在室温孵育,120min,。,6,）每孔加,3l,的,5%,伊红水溶液，染色,58min,。加,5l 12.3%,甲醛，终止反应。,7,）放入冰箱湿盒内静置,12h,或过夜。,82,血清学分型,4.,结果判读,在倒置相差显微镜下观察，计数着色细胞即死细胞所占细胞数目的百分比。一般认为死细胞,20%,为阳性反应，即表示该细胞膜上有与抗体相应的抗原。反之，无此种抗原。,83,血清学分型,4.,结果判读,淋巴细胞毒试验记分标准,死细胞（,%,）,记分,意 义,0,10,1,阴性,11,20,2,可疑阳性,21,40,4,弱阳性反应,41,80,6,阳性反应,81,100,8,强阳性反应,84,血清学分型,需要注意的问题：,在检测,HLA,抗原的过程中，凡受到细菌、真菌的污染，会使结果不正确。,操作时间过长、温度过低或过高亦会影响试验结果的准确性。,85,血清学分型,如果个体只检测出一个抗原，称为存在一个空白抗原，不能判断为一定是纯合子。例如,A1,，记作,HLA-A1,，,。,三种的可能原因：,是该抗原的纯合子,HLA,抗血清板不完全，缺少针对某抗原的抗体,漏检了一个抗原。,存在一种至今尚未发现的抗原。,86,血清学分型,：,HLA,抗体产生途径有以下几种：,通过妊娠、输血、同种器官移植等免疫作用，,产生同种抗体。,用纯化的,HLA,抗原免疫动物，产生异种抗体。,用杂交瘤技术，制备单克隆,HLA,抗体。,偶有“天然”,HLA,抗体。,大多数,HLA,抗体是免疫抗体，属,IgG,，少数为,IgM,。,HLA,抗体,87,血清学分型,：,根据与抗原决定簇的反应，,HLA,抗体分为,2,组：,HLA,抗体,1,抗体仅与一种,HLA,基因产物反应。这些抗体只与独有的表位结合，这些表位是单一的,HLA,等位基因产物。,2,抗体能与不止一种,HLA,基因产物结合。这种抗体与结构类似的独有表位或几种,HLA,基因产物的共有表位结合，产生血清学交叉反应。,88,血清学分型,：,原因：,HLA,抗原由同一个分子上高度关联的若干表位组成，,这些表位具有不同的免疫原性，可以刺激产生不同的,同种抗体；,两个结构类似的抗原决定簇可以与同一抗体结合；,HLA,的交叉反应可能是由“复合抗体和复合抗原”引起。,交叉反应,89,血清学分型,：,HLA,抗血清与交叉反应,HLA-A,基因座交叉反应,90,血清学分型,：,HLA,抗血清与交叉反应,HLA-B,基因座交叉反应,91,血清学分型,：,HLA,抗血清与交叉反应,HLA-DR,基因座交叉反应,92,血清学分型,HLA,血清学分型的关键是,HLA,抗血清。,不易获得特异抗血清，抗血清交叉反应明显,商品,HLA,分型板血清种类少,93,细胞学分型,采用淋巴细胞培养试验,HLA-D,与,DP,抗原特异性可分别通过纯合子分型细胞及预致敏淋巴细胞试验检测。,两种方法均以混合淋巴细胞培养（,MLC,）为基本技术，通过测定淋巴细胞在识别非己,HLA,抗原后发生的增殖反应来分型。,由于分型细胞来源困难以及操作手续繁琐，细胞学分型已渐被淘汰。,94,DNA,分型,届数,年份,主 要 内 容,第十一届,1991,年,确定了,146,种,HLA,抗原，建立了,HLA II,类的,PCR-SSCP,分型标准，并明确今后凡确定新的血清学特异性，均需有,DNA,序列分析及氨基酸序列分析的资料,第十二届,1996,年,研究,HLA,在,DNA,水平的变异及其免疫学功能，建立了,HLA I,类分子生物学分型方法,第十三届,2002,年,进一步研究,HLA,在,DNA,水平的变异及其生物学功能，建立了标准化,HLA DNA,测序的分型方法,95,针对核苷酸序列差异而设计,DNA,分型,PCR-RFLP,PCR-SSO(ASO),PCR-MPH,PCR-SSP,序列测定,96,DNA,分型方法优于血清学方法之处：,DNA,分型,1,.,便于标准化和相互比较结果,2.,对检材要求不高,3.,血清学和,DNA,分型不完全相同的分型误差得以解决,97,HLA,的群体分布,不同人群的,HLA,抗原分布有很大的差异，可能提供某些有关人类迁移和混杂的信息。,98,A1,A2,A3,A9,A10,A11,A28,A29,A30,A31,A32,A33,空白,合计,B5,1,286,27,124,2,116,15,2,3,29,1,11,1,618,B7,4,52,11,73,4,12,7,68,1,1,1,1,2,237,B8,17,28,9,1,16,1,1,1,1,1,1,1,1,79,B12,1,55,9,1,7,1,1,1,1,1,1,15,1,95,B13,13,178,25,74,1,444,27,9,50,65,8,1,10,905,14B,8,1,1,8,1,1,1,12,1,1,1,1,1,27,B15,48,160,1,155,8,691,4,18,1,38,1,27,151,1303,B16,1,259,58,64,13,188,1,1,4,5,8,1,22,625,B17,32,1,2,106,33,137,15,1,1,106,8,329,238,1009,B18,1,4,1,14,1,6,1,1,1,7,1,1,5,44,B21,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,1,13,B22,3,242,1,107,25,188,10,11,4,4,1,5,5,606,B27,1,22,14,22,4,81,10,1,9,21,1,1,1,188,B35,1,98,13,41,1,34,6,8,1,21,1,6,13,244,B37,9,1,1,1,1,1,1,1,1,9,1,1,1,29,B40,1,530,3,343,69,623,6,32,24,17,7,45,120,1820,B46,18,527,1,103,19,152,16,1,5,2,1,1,1,847,空白,6,549,61,275,40,342,1,1,1,1,1,1,32,1311,合计,166,2994,239,1513,246,3019,124,159,110,330,45,449,606,10000,中国北纬,30,度以南人群,HLA-AB,单倍型频率,(,10,-4, N=580),99,在亲子鉴定中的应用,否定父权,单独使用,HLA,分型，非父排除概率可达到,90%,左右，超过使用,ABO,、,MN,、,Rh,等,11,个红细胞血型系统及,Gm,、,Km,、,Hp,等,8,个血清型系统的总排除概率。,100,否定父权,(,逐个座位分析,),AF1 HLA-A2,11,；,B13, -,；,Cw4,w6,；,DR13,15,；,DQ7,9,AF2 HLA-A2,30,；,B46,60,；,Cw4,w6,；,DR12,13,；,DQ5,9,AF3 HLA-A11,30,；,B35,46,；,Cw1,w4,；,DR9,15,；,DQ4,7,M HLA-A11,24,；,B13,46,；,Cw3,w4,；,DR4,15,；,DQ6,7,C HLA-,A24,30,；,B13,35,；,Cw1,w3,；,DR4,9,；,DQ4,6,在亲子鉴定中的应用,101,在法医数据分析中，,HLA,不同基因座的累积概率不能简单使用各基因频率的乘积，而应该用单倍型频率，否则会导致过高或过低估计,HLA,系统的鉴定能力。,以单倍型频率作为父权指数的计算依据。,确信父权,在亲子鉴定中的应用,102,致 谢：,感谢为本课件提供图片等资料的所有网站、,机构和个人,!,103,