1_质粒DNA的提取酶切及浓度检测

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second Level,Third Level,Fourth Level,Fifth Level,8,实验,5,质粒,DNA,的提取,质粒的概念,质粒：质粒是细菌染色体外的遗传物质，大小在,1200kb,之间，大多是具有双股闭合环状结构的,DNA,分子，通常以超螺旋状态存在于细胞浆中。,质粒提取目的,PCR,的模板,质粒作为克隆载体,(,研究目的基因时，常需要提取质粒,),质粒提取的方法与原理,碱裂解法,SDS,裂解法,煮沸裂解法,氯化铯,-,溴化乙锭梯度离心法,试剂盒法,碱裂解法,溶液,1,50mmol/L,葡萄糖，,10mmol/L EDTA,，,25mMTris-HCl pH8.0,。,溶液,2,0.2mol/L,NaOH, 1%SDS,溶液,3,乙酸钾溶液,(3M, pH=4.8),：,60mL,的,5mol/L,KAc,11.5ml,冰醋酸，,28.5mL H,2,O,培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到,1.5-3ml,含有相应抗生素的液体培养基，,37,培养,12,16,小时,;,取液体培养液,1.5-3ml,于,Eppendorf,管中，,10000r/min,离心,1min,，,去掉上清液，加入,100,l,溶液,1,充分混匀放置,3-5,分钟,;,加入,200,l,新配制的,0.2mol/L NaOH+1,SDS,（,变性液），加盖颠倒,3-5,次使之混匀，冰上放置,5min;,质粒小量提取的方法（手工提取）：,加入,150,l,乙酸钾溶液,(,溶液,II,I,),，,加盖后颠倒,3-5,次混匀，,冰上放置,5min,;,用台式高速离心机，,12000r/min,离心,15min,，,上清移入另一干净离心管，并加,2,倍,100,乙醇混匀，,12000r/min,离心,5min,，,弃去上清液,;,沉淀用,0.5ml 70,乙醇清洗一次，,12000r/min,离心,5min,，,弃去上清液，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥,;,加入,30-50,l,含有,20,g/ml,RNase,的灭菌蒸馏水或,TE,缓冲液溶解提取物，室温放置,15-30min,，使,DNA,充分溶解,(,有时需要酚,:,氯仿抽提,);,将分离出的质粒,DNA,置于,-20,保存备用。,注意：,用移液器操作时，每一步都要格外小心，特别是在加入溶液,II,和,III,后，一定不要剧烈振荡，以免切碎,DNA(,包括质粒,DNA,和基因组,DNA),！,质粒小抽试剂盒,原理：把硅胶薄膜的优点与经典的碱,-SDS,裂解细菌细胞法结合起来。,优点：操作简便、节约时间、性,/,价比高。,使用者需备,10,000xg,以上高速离心机,1.5ml,的灭菌干净小离心管,灭菌去离子水,(,或,TE,缓冲液,),无水乙醇,注意,一、使用前往准备好的,SolutionI,中加入,RNase,A,，,二、浓缩的,Wash Buffer,需用乙醇稀释：,三、稀释后的,DNA Wash Buffer,需室温保存；,四、所有步骤必须在室温下操作。,实验操作步骤,增殖细菌、扩增质粒,裂解菌体、获取质粒,抽提质粒、分离纯化,结果鉴定,对于未经酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带,1,）（松弛）螺旋状质粒,DNA,带,2,）超螺旋状质粒,DNA,的带,以超螺旋状质粒,DNA,居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒,DNA,在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒,DNA,之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。,质粒,DNA,提取范例：,质粒,DNA,的酶切鉴定,1.,实验目的和要求,学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解操作方法，并理解限制性内切酶是,DNA,重组技术的关键工具。,2.,相关基础知识,限制性核酸内切酶：是一类能识别双链,DNA,分子特异性核酸序列的,DNA,水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是,DNA,重组中重要的工具，而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。,1),限制性核酸内切酶的类型及特性,按限制酶的组成、与修饰酶活性关系,以及,切断核酸的情况不同，分为三类,：,型,型*,型,II,型 限制性内切酶,能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是,DNA,重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是,4,个或,6,个核苷酸,II,型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向,“,读,”,都完全相同。,这种酶的切割可以有两种方式：,粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。,如,EcoRI,的识别顺序为：,5,GAA|TT_C,3,3,C_TT|AAG,5,垂直线表示中心对称轴，从两侧,“,读,”,核苷酸顺序都是,GAATTC,或,CTTAAG,，,这就是回文顺序（,palindrome,）。,_,和,表示在双链上交错切割的位置,II,型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如,Eco,RV,的识别位置是：,5,GAT,|ATC,3,3,CTA,|TAG,5,这种末端同样可以通过,DNA,连接酶连接起来。,平头末端：,2),影响核酸限制性内切酶活性的因素,(1) DNA,的纯度；,(2) DNA,的甲基化程度；,(3),酶切消化反应的温度；,(4) DNA,的分子结构；,(5),溶液中离子浓度及种类；,(6),缓冲液的,pH,值。,3.,实验材料与仪器,质粒,标准分子量片段,( DNA Ladder),Eco,RI,和,Hind,核酸内切酶（,Takara,）,Eco,RI,和,Hind ,酶解缓冲液,(10,M buffer),琼脂,糖,TBE,或,TAE,缓冲液,(10,),溴化乙啶染色液,(10mg/ml),上样液,(6,),：,0.25%,溴酚兰，,40,(W/V),蔗糖 水溶液 。,缓冲液,因为不同的酶所要求的最适反应条件不同，所以一定要使用与酶相匹配的缓冲系统。一般按照销售酶的公司所提供的相应缓冲液。双酶切或多酶切时要考虑相容性缓冲液问题，一般公司会给用户提供这方面的信息。,Eco,R,I,酶切位点：,GAATTC,Hind ,酶切位点：,AAGGCT,质粒量（,ng,）,缓冲液,(,l,)*,EcoR,1,（,l,）,Hind ,（,l,）,总体积,（,l,）,200(5,l,),1,0.5,0.5,10,* 缓冲液随不同的酶而不同,本实验用,M buffer,。,置于,37,水浴酶解,0.5-1,小时。酶解完成后，分别加入,3,l,的上样缓冲液,然后进行电泳分析。,1),质粒,DNA,的酶解,4.,实验方法和步骤,实验结果,1,2 3 M 1 2 3 M 1 2 3,未酶切质粒,；,2.,Eco,RI,单酶切；,3.,Eco,R1+,Hind ,双酶切,M. DNA Marker.,