CHAP1-酶工程基础

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一章 酶工程基础,第一节 酶和酶工程概述,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,第三节 酶的催化特点和影响因素,第四节 酶活力的测定,第五节 酶动力学和抑制作用,第一章 酶工程基础,第一节 酶和酶工程概述,一、酶及酶工程研究的意义,二、酶学研究简史,三、酶工程,第一节 酶和酶工程概述,第一节 酶和酶工程概述,（一）酶的概念,酶是由细胞产生的具有催化功能的蛋白质（或核酸），亦称生物催化剂。,一、酶及酶工程研究的意义,第一节 酶和酶工程概述,如：,苯丙酮尿症,(PKU),患儿的,苯丙氨酸羟化酶,先天缺失，不能将苯丙氨酸转化为酪氨酸，苯丙氨酸在血液中累积，使大脑发育受到影响；,同时由于酪氨酸来源减少，致使黑色素合成不足，出现皮肤,“,白化病,”,。,酶催化的生物化学反应，称为,酶促反应,（,Enzymatic reaction,）,在酶的催化下发生化学变化的物质，称为,底物,（,substrate,）,第一节 酶和酶工程概述,（二）酶在生命体内的重要性,1,、催化生物代谢过程中的各种生化反应，以维持正常的生命活动。,2,、核酸合成、复制要靠酶；出了差错，要靠修复酶进行纠正。,3,、蛋白质合成，一旦错误氨基酸掺入，就要有专门的酶去识别、切除、再合成。,第一节 酶和酶工程概述,1,、以酶为工具的研究,2,、以酶为研究对象,（三）酶的研究,第一节 酶和酶工程概述,（,1,）用酶来治疗疾病,天冬酰胺酶,治疗白血病,多酶片,(,蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等,),助消化,链激酶、尿激酶、纳豆激酶等,清除血凝块,1,、以酶为工具的研究,（,2,）基因工程用酶：,内切酶、连接酶、,TaqDNA,聚合酶、逆转录酶等。,酶 名,来 源,用 途,淀粉酶,胰脏、麦芽、微生物,治疗消化不良，食欲不振,蛋白酶,胰脏、胃、植物、微生物,治疗消化不良，食欲不振，消炎，消肿，除去坏死组织，促进创伤愈合，降低血压,脂肪酶,胰脏、微生物,治疗消化不良，食欲不振,纤维素酶,霉菌,治疗消化不良，食欲不振,溶菌酶,蛋清、细菌,治疗各种细菌性和病毒性疾病,尿激酶,人尿,治疗心肌梗塞，结膜下出血，黄斑部出血,链激酶,链球菌,治疗血栓性静脉炎，咳痰，血肿，下出血，骨折,青霉素酶,蜡状芽孢杆菌,治疗青霉素引起的变态反应,L-,天冬酰胺酶,大肠杆菌,治疗白血病,超氧化物歧化酶,微生物，植物，动物,预防辐射损伤，治疗红斑狼疮，皮肌炎，结肠炎,凝血酶,动物，蛇，细菌，酵母等,治疗各种出血病,胶原酶,细菌,分解胶原，消炎，化脓，脱痂，治疗溃疡,右旋糖酐酶,微生物,预防龋齿,胆碱酯酶,细菌,治疗皮肤病，支气管炎，气喘,溶纤酶,蚯蚓,溶血栓,弹性蛋白酶,胰脏,治疗动脉硬化，降血脂,核糖核酸酶,胰脏,抗感染，祛痰，治肝癌,尿酸酶,牛肾,治疗痛风,L-,门冬酰胺,L-,门冬氨酸,+NH,3,天冬酰胺酶治疗白血病,天冬酰胺酶能将血清中的门冬酰胺水解，而,门冬酰胺是细胞合成蛋白质及增殖生长所必需的氨基酸,；,正常细胞有自身合成门冬酰胺的功能，而急性白血病等肿瘤细胞则无此功能，因而当外来天冬酰胺酶使门冬酰胺急剧缺失时，肿瘤细胞因既不能从血中取得足够门冬酰胺，亦不能自身合成，使其蛋白质合成受阻，增殖受抑制，细胞大量死亡。,L-,天冬酰胺,L-,天冬氨酸,+NH,3,天冬酰胺酶治疗白血病,注入该酶后，人体正常,cell,由于有,L-,天冬酰胺合成酶，自己能够合成,L-,天冬酰胺，因此细胞蛋白质合成不受影响。而癌,cell,本身缺乏或没有,L-,天冬酰胺酶，自己不能合成,L-,天冬酰胺，外源的,L-,天冬酰胺又被,L-,天冬酰胺酶分解掉，因此细胞蛋白质的合成受到影响，引起癌,cell,的死亡。,第一节 酶和酶工程概述,（,1,）测定肝癌,A,、,开始：甲胎蛋白（,AFP,）,B,、,现在：,“,岩藻糖苷酶,”,（,AFU,）,（,2,）神经细胞内的酶,2,、以酶为研究对象,第一节 酶和酶工程概述,甲胎蛋白（,AFP,）是人胚胎期血清中的主要蛋白成分，其合成部位主要是在人类胚胎的肝脏。,人类胚胎在宫内发育,16,周后,AFP,迅速下降，当胎儿出生后,AFP,的浓度维持在较低水平；,研究表面：原发性肝癌患者血清中的,AFP,相当于正常人的数十倍乃至数万倍。,第一节 酶和酶工程概述,“,岩藻糖苷酶,”,（,AFU,）属溶酶体酸性水解酶类，参与含岩藻糖苷的糖蛋白、糖脂的降解、代谢。,研究表明：肿瘤组织中的岩藻糖转换率增加，,AFU,活性增高。,第一节 酶和酶工程概述,2005,年,3,月，中科院上海科学研究院的,袁小兵,博士等，在,自然,杂志上发表原创工作，首次发现神经细胞内有二种酶：,CDC42,酶和,RhoA,酶,。,功能：对神经纤维的生长导向作出精细的调节，对疼痛和止痛起调节作用。,神经细胞内的酶,第一节 酶和酶工程概述,二、酶学研究简史,公元前,800,年 烹调方法中已使用来自微生物的酶,1833-1835,年 淀粉的第一次酶解,1836,年 发现消化酶,-,胃蛋白酶,1839-1897,年,60,年关于酵母的争论,1876,年 酶,-,源于希腊语，意为,在酵母中,1883,年 食物中蛋白质的测定,1894,年 加酶食品的第一次商业化生产,1894-1913,年 科学家建立,“,钥匙,-,锁理论,”,1908-1913,年 在皮革软化过程中酶取代粪便,1914,年 第一次生产出浓缩洗衣皂,1926,年 科学家发现酶是蛋白质,第一节 酶和酶工程概述,1941-1943,年 生产胰岛素和胰蛋白酶的新方法,1953-1958,年,Watson,和,Crick,发现,DNA,是双螺旋结构,1963,年 碱性蛋白酶,-,洗涤剂用酶的突破,1967,年 微生物筛选,1965-1974,年 淀粉工业的重大突破,1984-1986,年 第一个由基因修饰的微生物生产的酶,1992,年 建立用于酶工业生产的克隆表达,1995,年 三维结构模型,1996,年 生物多样性网络,1997,年 利用分子筛选技术发现新的微生物,1998,年 基因混组,1999,年 生态克隆表达,2000,年,Fusarium venenatum,作为新的工程用菌,第一节 酶和酶工程概述,三、酶工程,（一）酶工程的概念,是将酶、细胞或细胞器等置于特定的生物反应装置中，利用酶所具有的生物催化功能，借助工程手段将相应原料转化成有用物质并应用于社会生活的一门科学技术。,是,酶学,、,微生物学,的基本原理与,化学工程,有机结合而产生的,交叉,科学技术，是生物工程的主要内容之一。,第一节 酶和酶工程概述,（二）酶工程的研究内容,酶的生产,酶的改造,酶的应用,天然酶在开发应用方免受到限制,第一节 酶和酶工程概述,（三）酶工程的分类,根据研究和解决问题的手段不同分为：,（,1,）,化学酶工程,：指天然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用。,（,2,）,生物酶工程,：,是,酶学,和以基因重组技术为主的现代,分子生物学,技术相结合的产物。主要包括,3,个方面,第一节 酶和酶工程概述,（,2,）生物酶工程,克隆酶,用基因工程技术大量生产酶（,-,淀 粉酶，青霉素酰胺酶、亮氨酸合成酶）,突变酶,对酶基因进行修饰，产生遗传修饰酶,合成新酶,设计新酶基因，合成自然界不曾有过的酶,第一节 酶和酶工程概述,（四）酶工程的研究方向,1,、酶的固定化,2,、酶如何不被体内酶识别、降解问题,3,、酶活性检测如何更简便、特异、快 速、灵敏的方法学问题,4,、酶的抑制剂与激活剂,5,、基因工程表达的酶制剂等,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,一、酶的分类,二、酶的命名,三、酶的组成和结构特点,四、酶的作用机制,一、酶的分类,1961,年国际酶学委员会提出将酶分为,6,类,：,1,.,氧化还原酶,：,R,H,+R(O,2,)=R+R,H,(,H,2,O),催化电子的转移,2,.,转移酶,：,R,G,+ R=R + R,G,催化功能基团的转移,3,.,水解酶,：,RR +,H,2,O,=R,H,+ R,OH,催化水解反应,4,.,裂合酶,：,RR=R + R,催化非水解性、非氧化性分解,5,.,异构酶,：,R=R,催化分子内基团的转移,6,.,连接酶,（合成酶）：,R+R+ATP=RR+ADP,利用共价键将分子连接到一起,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,核酶是唯一的非蛋白酶，它是一类特殊的,RNA,或,DNA,，能够催化,RNA,或,DNA,分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,7.,核酶（催化核酸）,ribozyme,脱氢酶,：催化直接从底物上脱氢的的反应，需要辅酶,I(NAD+),或辅酶,(NADP,+,),作为氢供体或氢受体起传递氢的作用）,氧化酶,：催化底物脱氢，并氧化生成,H,2,O,2,或,H,2,O,等。,例如：乳酸脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。,1.,氧化,-,还原酶,Oxidoreductase,催化基团转移反应：即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。,例如：,谷丙转氨酶,催化的氨基转移反应。,2.,转移酶,Transferase,催化：底物的加水分解反应。,主要包括：淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。,例如：脂肪酶,(Lipase),催化的脂的水解反应,3.,水解酶,hydrolase,催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。,例如,:,延胡索酸水合酶催化的反应,4.,裂合酶,Lyase,催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。,例如,:6-,磷酸葡萄糖异构酶催化的反应,。,5.,异构酶,Isomerase,又称为合成酶，能够催化两个物质形成一个新物质的反应,这类反应必须与,ATP,分解反应相互偶联。,例如,:,丙酮酸羧化酶催化的反应,丙酮酸,+,CO,2,草酰乙酸,6.,连接酶,Ligase or Synthetase,二、酶的命名,（一）习惯命名,（二）系统命名,（三）酶的编号,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（一）习惯命名,根据,作用底物,（,S,）：淀粉酶 蛋白酶,反应性质,：脱氢酶 转氨酶,两者结合,：乳酸脱氢酶 谷丙转氨酶,来源,：胃蛋白酶 木瓜蛋白酶,性质,：碱性磷酸酯酶,（二）系统命名,命名原则,底物,1,：底物,2,+,反应类型,+,酶,“,L-,乳酸：,NAD,+,氧化还原,+,酶,”,乳酸脱氢酶,（习惯命名）,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（三）酶的编号,酶的编号,用四个数字表示一个酶：,Enzyme Commision,EC,1,.,1,.,1,.,1,醇脱氢酶,类 亚类,亚亚类,编号,第,1,大类,;,以,CHOH,为供体,;,以,NAD,+,NADP,+,为受体,;,1,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,三、酶的组成和结构特点,（一）酶的组成形式,1.,单体酶,( monomeric enzyme),：,由一条或多条肽链组成，肽链间以,共价键,结合的酶。,2.,寡聚酶,(oligomeric enzyme),：,由若干相同或不相同的亚基以,非共价键,结合而组成，亚基一般没有活性，必须相互结合后才有活性。,3.,多酶复合体,(multienzyme system),：,由,2,个或,2,个以上功能相关的酶通过,非共价键,连接而成的、能进行,连续反应的体系,就是多酶复合体。,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（二）酶的结构特点,(holoenzyme),（,apoenzyme,）,(cofactor),全 酶,=,酶蛋白,+,辅因子,（金属离子、辅酶、辅基）,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（,金属离子,） （,辅酶、辅基,）,有活性 无活性 无活性,无机离子 有机化合物,1,、金属离子,（,1,）分类,（据结合程度不同）,金属酶：,酶蛋白与金属离子结合紧密，主要是一些过渡金属离子。,金属激酶：,金属离子与酶的结合一般较松散，在溶液中，酶与这类离子结合而被激活。主要是一些碱金属离子或碱土金属离子。,（,2,）作用,活性中心的组成成分,：,如多酚氧化酶中的铜,在,E,与,S,之间起作用：,如羧肽酶中的锌,稳定结构,2,、辅酶、辅基,（,1,）根据与酶蛋白的结合程度可分为,辅酶,(coenzyme),：指与酶蛋白结合比较松弛的小分子有机物质，通过透析方法可以除去。,例如硫胺素、焦磷酸。,辅基,(prosthetic group),：是以共价键和酶蛋白结合，结合的较紧密，不能通过透析法除去，需要经过一定的化学处理才能与酶蛋白分开。,例如,FAD,：黄素腺嘌呤二核苷酸，,FMN,：黄素单核苷酸。,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,维生素的特点,:,1,、种类多,2,、需要量少,3,、常常需要从食物中获得,4,、大部分充当辅酶,（,2,）辅酶、辅基往往是由,维生素,参与形成的小分子有机物,脂溶性维生素：,A D E K,维生素,硫辛酸（氧化型）,水溶性维生素：,Vc,V,B,:,B,1,B,2,B,3,（泛酸）,B,5,(PP),B,12,（氰钴胺素）,B,6,（吡哆醇,/,醛,/,胺）,B,7,(,生物素 ）,B11,（叶酸）,硫辛酸（还原型）,维生素,B,1,硫胺（素）,NH,2,H,3,C,CH,2,N,CCH,3,HC,CCH,2,CH,2,OH,S,Cl,P,P,硫胺素,（,B,1,）,功 能：,以辅酶方式参加糖的分解代谢。,TPP,是,脱羧,酶、脱氢酶的辅酶,。,缺乏症：,脚气病、中枢神经和肠胃患糖代谢失常。,焦磷酸硫胺素,（,TPP,）,维生素,B,2,核黄素,功能,：作为递氢辅酶，参与生物氧化作用,每人每天需要量,：儿童,0.6mg,，成人,1.6mg,。动物体内不能合成维生素,B,2,。,缺乏症,： 口角炎、舌炎、唇炎、眼睑炎，角膜血管增生等症状。,维生素,B,3,泛酸,、,遍多酸,功能：,以,CoA,形式参加代谢，是酰基的载体，是体内,酰化酶的辅酶,，对糖、脂、蛋白质代谢过程中的乙酰基转移有重要作用。,需要量：,成人每天为,510mg,，,一般膳食的泛酸含量丰富。,未发现典型的缺乏症。,维生素,B,5,维生素,PP,包括尼克酸（烟酸）和尼克酰胺，,尼克酰胺为,维生素,B,5,的化学名。,N,COOH,N,CONH,2,尼克酸,尼克酰胺,功能：,以,NAD,+,或,NADP,+,形式作为,脱氢酶的辅酶,而起到递氢体的作用。,N,CONH,2,R,N,CONH,2,R,H,H,+2H,-2H,NAD(P),+,+2H,-2H,NAD(P),H,+,H,+,缺乏症：,膳食中长期缺乏维生素,PP,会引起,对称性皮炎,，又叫,赖皮病,。,维生素,B,6,吡哆素,包括：,吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺。,N,CH,2,OH,CH,2,OH,HO,H,3,C,N,CH,2,OH,CHO,HO,H,3,C,N,CH,2,OH,CH,2,NH,2,HO,H,3,C,吡哆醇,吡哆醛,吡哆胺,N,CH,2,O,CHO,HO,H,3,C,P,（磷酸吡哆醛，,PLP,）,功能：,作为辅酶参加多种代谢反应，包括,脱羧、转氨、氨基酸内消旋、,Trp,代谢、含硫氨基酸的脱硫、羟基氨基酸的代谢和氨基酸的脱水,等。,缺乏症：,导致皮肤、中枢神经系统和造血机构的损害，可以引发,皮炎,。,维生素,C,抗坏血酸,功能：,促进各种支持组织及细胞间粘合物的形成，是,脯氨酸羟化酶,的,辅酶,。,对生物氧化有重要作用。,缺乏症：,坏血病，,毛细血管易出血，齿、骨发育不全或退化。,四、酶的作用机制,（一）酶的结构组成及活性中心,（二）酶作用专一性机理,（三）酶作用高效性机理,（四）影响酶高效性的因素,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,（一）酶的结构组成及活性中心,结合部位,活性中心,必需基团,催化部位,酶的结构 活性中心以外的必需基团,其它部分,1,、,酶的活性中心,(,active center),：,是指结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。,活性中心,结合部位,催化部位,调控基团,中心外必需基团,中心内必需基团,2,、结合部位：,酶分子中与底物结合，使底物与酶的一定构象形成复合物的基团。,酶的结合基团决定酶反应的,专一性,。,3,、催化部位：,酶分子中催化底物发生化学反应并将其转变为产物的基团。,催化基团决定酶所催化反应的性质，同时也是决定反应的,高效性,。,4,、调控基团：,酶分子中一些可与其他分子发生某种程度的结合并引起酶分子空间构象的变化，对酶,起激活或抑制作用,的基团。,酶的活性中心示意图,一些酶活性中心的基团,（二）酶作用,专一性,机理,1.,锁钥模型,2.,诱导契合模型,酶作用的专一性,专一性,：一种酶只能作用于一种或一类底物。,表现为：,（,1,）,绝对专一性,：一种底物，一个反应。,如尿酶尿素,（,2,）,相对专一性,：大多数酶为相对专一,性，允许底物分子上有小变动。,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,1,、锁钥模型（,1890,）：,认为整个酶分子的天然构象是具有,刚性,结构的，酶活性部位的形状与所需作用的底物形状相吻合，它们可以象钥匙与锁一样互相匹配。,此学说可以较好的解释酶的,立体异构专一性,；但不能解释,酶的多底物现象、酶对正反方向的催化等。,锁钥模型,2,、诱导契合模型（,1964,年 ）：,该学说认为酶的,活性部位并不是和底物的形状正好互补的,，而是在酶和底物结合的过程中，由于,酶与底物相互诱导,，使底物分子或酶分子，有时是两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这个动态的辨认过程称为,诱导契合,。,诱导契合模型,动画,酶与底物靠近,定向,酶与底物相互诱导变形,契合形成中间产物,产物脱离,A.,靠近,定向,靠近,电性吸引疏水作用,定向,酶,底物,诱导契合机制,B.,诱导,契合,活性中心催化基团进行催化,诱导,互补性结构变化,能否契合,专一性的由来,契合,C.,产物脱离,酶复原,催化剂,非酶促反应,S P,酶促反应,S+E ES P+E,S+E ES,ES,EP,P+E,底物,酶中间物,过渡态,产物,酶中间物,酶作用的实质：,在于降低,反应活化能,！,（三）酶作用高效性机理,中间产物学说,（,过渡态学说,）,区别,：反应分两步走，活化能大大降低，因此反应容易进行。,（四）影响酶高效性的因素,1.,邻近定向效应,2.,变形或张力,3.,广义的酸碱催化,4.,共价催化（亲核催化,/,亲电催化）,5.,酶的活性中心为疏水区域,1,、邻近效应、 定向效应,邻近效应：,在酶促反应中，由于酶和底物分子之间的亲和性，底物分子有向酶的活性中心靠近的趋势，最终结合到酶的活性中心，使底物在酶活性中心的有效浓度大大增加的效应,。,定向效应：,当专一性底物向酶活性中心靠近时，会诱导酶分子构象发生改变，,使酶活性中心的相关基团和底物的反应基团正确定向排列，,同时使反应基团之间的分子轨道以正确方向严格定位，使酶促反应易于进行。,以上两种效应使酶具有,高效率,和,专一性,特点。,邻近定向效应,普通化学反应,随机碰撞（受浓度、碰撞角度影响）,相当于,社会上的自由恋爱,酶的活性中心,相当于,“,婚姻介绍所,”,邻近作用,提高了,酶活性（,“,婚介,”,）中心的,底物浓度（,非婚男女集中）,定向作用,缩短了,底物与催化基团间（,“,男女,”,）,的距离,提高反应速度（,成功率,）,10,8,倍,2.,变形或张力,当酶与底物靠近时，不仅酶构象受底物作用而变化，底物分子也常常受酶作用而变化，也就是酶使,底物分子中的敏感键发生,“,变形,”,或产生张力,，从而促使底物中的敏感键更易于破裂。因而更容易形成一个互相契合的,酶,底物的复合物,而提高催化效率。,底物分子发生形变,酶,底物,同时形变,产物,3,、广义的酸碱催化,广义的酸碱催化：,是通过瞬时的向反应物提供质子,（,H,+,）,或从反应物接受质子以稳定过渡态，加速反应的一类催化机制。,酶分子中可以作为广义酸、碱的基团,广义酸基团 （质子供体） 广义碱基团（质子受体）,酸的催化,：,H,+,与反应物结合，其结合物更有反应性，因而反应速度大为加快。,碱的催化,：从反应物上移去,H,+,，反应速度也大为加快。,许多反应中既受酸的催化，也受碱的催化。,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,4,、共价催化,（,1,）共价催化：,酶通过与底物形成反应活性很高的,共价过渡产物,，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程。,（,2,）它包括两种类型：,亲核催化,和,亲电催化,亲核基团：,His,的咪唑基，,Cys,的硫基，,Asp,的羧基，,Ser,的羟基等；,亲电子基团：,H,+,、,Mg,2+,、,Mn,2+,、,Fe,3+,某些辅酶，如,焦磷酸硫胺素,和,磷酸吡哆醛,等也可以参与共价催化作用。,催 化 机 理,第二节 酶的分类、命名、组成、结构特点和作用机制,亲电催化：,亲电基团具有强烈亲合电子的原子中心，它的催化机理与亲核试剂正好相反。,亲核催化：,亲核基团具有强烈供给电子的原子中心。它能发挥催化作用是由于能供给底物一对电子，因此可与底物共价结合。,5,、酶的活性中心为疏水区域,酶活性中心处于一个非极性环境中，其介电常数比在水介质（极性介质）中的介电常数低，在非极性环境中两个带电基团之间的,静电作用,比在极性环境中显著增高，从而,有利于同底物的结合,。,综上所述，酶催化作用机理：,酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契合）或底物变形使二者相互适合，并依靠离子键、氢键、范德华力的作用和水的影响，结合成中间产物，在酶分子的非极性区域内，由于酶与底物的邻近、定向，使二者可以通过亲核,亲电催化、一般酸,碱催化等催化方式进行多元催化，从而大大降低反应所需的活化能，使酶促反应迅速进行。,第三节 酶的催化特点和影响因素,一、酶的催化特点,（,一,）高催化效率,（,二,）强专一性,（,三,）可调节性,（四）活性的不稳定性,第三节 酶的催化特点和影响因素,（一）高催化效率,在,37,或更低的温度下，酶的催化速率是,没有催化剂,催化的化学反应速率的,10,12,10,20,倍 ；,比,一般催化剂,催化的反应速率,高,10,7,10,13,倍 。,第三节 酶的催化特点和影响因素,第三节 酶的催化特点和影响因素,以固氮酶为例,（,NH,3,的合成）,：,植物中,：,25,和中性,pH,下由固氮酶完成。,工业上,：由氮和氢合成氨需要在,10-90MPa,条件下，还要有铁及其它微量金属氧化物作催化剂才能完全反应。,第三节 酶的催化特点和影响因素,专一性,结构专一,立体异构专一,绝对专一,相对专一,键专一,基团专一,旋光异构专一,顺反异构专一,（二）强专一性,修整作用专一性,第三节 酶的催化特点和影响因素,（,1,）键专一,：只要求合适的化学键，对键两端的基团并无严格要求。,（,2,）基团专一,：不但要求一定的化学键，还要求键,一端,的基团是一定的。,a-,葡萄糖苷酶,a-,糖苷键,糖苷键的一端是葡萄糖,底物：蔗糖、麦芽糖,（,1,）,旋光异构专一性：,（,2,）,顺反异构专一性：,例如,：,DNA,聚合酶,I,：校正、切除错配核苷酸,氨酰,-tRNA,合成酶,：校正、切除错配,AA,修整作用专一性,：,酶存在校读功能，能对错误参入的核苷酸,、,氨基酸进行修正。,第三节 酶的催化特点和影响因素,（三）可调节性,酶活性的调节控制主要有,7,种方式：,1.,酶浓度的调节,2,.,激素调节,3.,共价修饰调节,：在一种酶分子上，共价地引入一个基团从而改变它的活性。,4,.,限制性蛋白水解作用与酶活力调控,5.,激活剂、抑制剂的调节,6,.,反馈调节,7.,金属离子和其他小分子化合物的调节,诱导或抑制酶的合成,调节酶的降解,第三节 酶的催化特点和影响因素,2.,激素调节,乳糖合成酶,催化亚基,修饰亚基,+,半乳糖,+,葡萄糖乳糖,激素,乳糖合成酶,第三节 酶的催化特点和影响因素,4.,限制性蛋白水解作用与酶活力调控,酶原,酶在生物体内首先合成出来的无活性前体。,酶原的激活,酶原必须在一定的条件下去掉一个或几个特殊的肽键，从而使酶的构象发生一定的变化，才有活性，这一过程称为酶原激活。,本质：,酶的活性中心,形成,或,暴露,的过程,意义,：避免自身受损伤,6.,反馈调节,反馈抑制,：催化此物质生成的第一步反应的酶，往往可以被它的终端产物所抑制，这种对自我合成的抑制就叫反馈抑制。例如：,苏氨酸脱氢酶,底物,异亮氨酸,抑制,第三节 酶的催化特点和影响因素,二、影响酶活力的因素,（一）,底物浓度,（二）,产物浓度,（三）,酶浓度,（四）,温度,（五）,pH,（六）,抑制剂,（七）,激活剂,一、底物浓度,S,在低底物浓度时：,反应速度与底物浓度成正比，表现为,一级反应,特征。,随着底物浓度的增高：,反应速度不再成正比例加速；反应为,混合级反应,。,当底物浓度达到一定值：,反应速度达到最大值,（,V,max,），,此时再增加底物浓度，反应速度不再增加，表现为,零级反应,。,(1),低,二、产物浓度,正反馈调节：,反应的中间产物或终产物能够起激活变构剂的作用，使酶促反应速率加快。,负反馈调节：,反应的中间产物或终产物对酶起变构抑制作用，使酶促反应速率降低。,三、酶浓度,在一定条件下酶促反应的速度与酶的浓度成正比。,当,底物浓度达到饱和,时，增加酶的浓度可增加反应速度，酶促反应的速度与酶的浓度成正比关系。,四、温度,温度对酶促反应速度的影响：,a.,温度升高,增加底物分子的热能，酶促反应速度加快，一般温度每升高,10,，反应速度约增加,1,倍；,b.,温度升高超过一定范围,会引起酶三维结构发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失，反应速度,很快下降,。,最适温度,（,optimum temperature,）,：,使酶促反应速度达最大时的温度。,五、,pH,a,、影响酶分子构象的稳定性,b,、影响酶分子（包括辅因子）必需基团的解离状态，影响酶与底物的结合；,c,、影响底物分子的解离状态。,最适,pH,（,optimum pH,）,：,酶反应速度最大,时的溶液,pH,。,pH,值影响酶活力的原因：,六、抑制剂,抑制作用：,通过与酶分子上的某些必需基团结合，使这些基团的结构和性质发生改变，从而引起酶活力下降或丧失，这种作用称为抑制作用。,变性作用,：,变性剂,七、激活剂,(activator,）,（,1,）无机离子,：,金属离子,（,K,+,Na,+,Mg,2+,Zn,2+,Fe,2+,Ca,2+,）、阴离子（,Cl,-,Br,-,）、氢离子,（,2,）小分子有机化合物,：,某些还原剂、乙二胺四乙酸（,EDTA,）,（,3,）生物大分子,（主要是激活酶原）,无活性的酶原 有活性的酶,激活作用,磷酸化酶,b,磷酸化酶,b,激酶,金属离子,的激活作用,许多金属离子是,酶的辅助因子,，是酶的组成成分，参与催化反应中的电子传递。,有些金属离子可与酶分子肽链上侧链基团结合，,稳定酶分子的活性构象,。,有的金属离子通过,生成螯合物,，在酶与底物结合中起桥梁作用。,酶活力,：也称,酶活性,，指酶催化一定化学反应的能力。其大小可用在一定条件下，它所催化的某一化学反应的,反应速率,来表示，两者呈线性关系。,所以测定酶的活力就是测定酶的反应速率。,酶反应速率,：用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。,单位：浓度,/,单位时间,一、酶活力与酶反应速率,第四节 酶的活力测定,产物浓度,酶反应速率曲线,时间,1,、底物浓度的降低；,2,、酶的部分失活；,3,、产物对酶的抑制；,4,、产物增加引起的逆反应速度的增加。,斜率,=,浓度,/,时间,=,引起酶反应速率降低的主要原因：,酶的活力单位：,1,、“国际单位”（,IU,）,：,1961,年提出，,1,个酶活力单位是指在该酶的,最适条件,(,最适底物浓度和最适,pH,）,下，,25,C,、,1,分钟,内能催化,1,微摩尔,底物所需的,酶量,，或催化,1,微摩尔产物形成所需的酶量。,1 IU = 1,mol/min,2,、,Kat,：,1972,年提出，最适条件下，,25,C,、,每秒钟,能催化,1,摩尔,底物转化为产物所需的酶量。,1 Kat = 1 mol/s,1Kat = 610,7,IU,二、酶的比活力,代表酶的纯度，,用每,mg,蛋白质所含的酶活力单位数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶的纯度愈高。,酶的比活力,=,酶活力（,单位）,/ mg,（蛋白）,单位：,用,IU/mg,蛋白、,Kat/mg,蛋白表示。,比活力大小可用来比较每单位质量蛋白质的催化能力。,三、酶活力的测定方法,终止法：,在恒温系统中进行酶促反应，间隔一段时间后终止反应，然后测定反应物的消耗量或产物的生成量，从而计算出酶活性。,终止反应的方法有,加热、强酸、强碱、三氯乙酸、,SDS,、乙醇等。,连续反应法：,不需要取样终止反应，而是基于反应过程光谱吸收、气体体积、酸碱度、温度等的变化，用仪器跟踪监测反应，记录结果，算出酶活力。,三、酶活力的测定方法,1.,分光光度法：,利用,底物和产物,在紫外或可见光部分的光吸收的不同，选择一适当的波长，测定反应过程中反应进行的情况。,优点：,简便、节省时间和样品，可检测到,nmol/L,水平的变化。,2.,荧光法：,主要是根据,底物或产物,的荧光性质的差别来进行测定。,3.,酶联测定法,：,许多酶促反应中，产物出现或底物的消失并不会引起光吸收的变化。在这种情况下要测定催化此反应的酶的活力，可将其,与第二个具有特殊吸收光变化的酶反应相偶联,。,酶与底物的中间产物学说,一、米氏方程,(,米曼氏公式,),S+E ES P+E,底物浓度与酶反应速度关系的数学表达式：,第五节 酶动力学和抑制作用,米氏常数,1,、米氏常数,Km,：当,v=1/2 V,max,时的底物浓度,Km=S,Km,值：,是当酶促反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度，它的单位是,mol/L,，与底物浓度的单位一样。,米氏常数,Km,k2 + k3,k1,第五节 酶动力学和抑制作用,Km=,k1 k3,E+S ES E+P,k2,k1k2k3,：速率常数,E,：酶,S,：底物,ES,：酶,-,底物复合物,P,：产物,2,、关于米氏常数,Km,的几点说明,（,1,）,Km,是,ES,复合物,稳定性的量度,（,2,） 对许多酶而言，,k2,比,k3,大得多，这时的,Km,就变成了,酶对底物的亲和力的量度,，因为它的值分别依赖于,ES,的生成或解离（即,k1,、,k2,的值）。,高,Km,值弱底物结合,（,k2,k1,）,低,Km,值强底物结合,（,k2,k1,）,2,、关于米氏常数,Km,的几点说明,（,3,）不同的酶具有不同,Km,值，它是酶的一个重要的,特征物理常数,，,只与酶的性质有关，而与其浓度无关,。,（,4,）,Km,值只是在固定的底物，一定的温度和,pH,条件下，一定的缓冲体系中测定,得到,的，,不同条件下具有不同的,Km,值。,（,5,）同一种酶有几种底物就有几个,Km,值，其中,Km,值最小的底物,一般称为该酶的,最适底物或天然底物,。,1,、抑制作用与抑制剂,2,、抑制作用的类型和特点,3,、一些重要的抑制剂,4,、酶抑制剂的应用（,P222,）,二、酶的抑制作用,1,、抑制作用与抑制剂,抑制作用：,由于酶分子上的某些,必需基团化学性质的改变,，而引起酶活力下降或丧失，但并不使酶蛋白变性的现象称为抑制作用。,（,抑制作用不同于,失活作用）,抑制剂,（,inhibitor,）,：,能够引起抑制作用的物质，可以是正常细胞代谢物，也可以是外源物质。,（抑制剂不同于变性剂）,2,、抑制作用的类型,（,1,）不可逆抑制作用,（,2,）可逆抑制作用,竞争性抑制,非竞争性抑制,反竞争性抑制,专一性,不可逆抑制作用,非专一性,不可逆抑制作用,（,1,）,不可逆抑制作用,(irreversible inhibition),定义：,抑制剂与酶的活性中心的功能基团,共价结合,而抑制酶的活性,不能用,透析或超滤,等物理方法除去抑制剂而,恢复酶活性,。,专一性不可逆抑制作用：,这类抑制剂只作用于某种酶活性部位的,必需基团,或,一类酶,。,非专一性不可逆抑制作用：,这类抑制剂作用于酶分子上,一类或几类不同的基团,或作用于,几类不同的酶,。,如：酰化剂酸酐和磺酰氯等可使酶蛋白的,-OH,、,SH,、,NH,2,等发生酰化而使酶失活。,不可逆抑制作用恢复酶活性的方法,例如：,有机磷杀虫剂,乙酰胆碱脂酶（,Ser-OH,）,不可逆抑制,解磷定,（,2,）,可逆抑制作用,(reversible inhibition),定义：,抑制剂与酶蛋白以,非共价,方式结合，引起酶活性暂时性丧失，抑制剂可以通过,透析等物理方法,被除去，并且能部分或全部恢复酶的活性。,根椐抑制剂与酶结合的情况，又可以分为三类：,可逆,竟争性,抑制,可逆,非竟争性,抑制,可逆,反竞争性,抑制,区别,可逆竟争性抑制,（,Competitiveinhibition,）,某些抑制剂的,化学结构,与底物,相似,，因而能与底物竟争与酶活性中心结合。当抑制剂与活性中心结合后，底物被排斥在反应中心之外，其结果是酶促反应被抑制了。,竟争性抑制通常可以通过增大底物浓度，即提高底物的竞争能力来消除。,S,例,1,：丙二酸和戊二酸对琥珀酸脱氢酶结合但不能催化脱氢。,可逆竞争性抑制示意图,I,例,2,：磺胺类药物及其作用机理,磺胺类药物可以抑制细菌的生长繁殖，治疗细菌引起的各种疾病。,磺胺类药物是,对氨基苯磺酰胺,或其衍生物，它是,对氨基苯甲酸,的,结构类似物,，竞争性抑制,二氢叶酸合成酶,。,对磺胺类药物敏感的细菌,在生长繁殖时，不能直接利用环境中的叶酸；,人类,能直接利用食物中的叶酸，核酸的合成不受磺胺类药物的干扰。,对氨基苯甲酸,（底物）,+,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸,（前体）,四氢叶酸,（辅酶）,合成嘌呤核苷酸,磺胺类药物,（对氨基苯磺酰胺或其衍生物）,+,可逆竞争性抑制,可逆非竟争性抑制,（,Noncompetitive inhibition,）,酶可同时与底物及抑制剂结合，即,底物和抑制剂没有竞争作用,。酶与抑制剂结合后，还可与底物结合；酶与底物结合后，也可再结合抑制剂，但是,三元的中间产物,不能进一步分解为产物，所以酶活性降低。,可逆非竞争性抑制剂与,酶活性中心以外的基团,结合，这类抑制作用不会因提高底物浓度而减弱。,可逆非竞争性抑制示意图,非竞争,可逆反竞争性抑制,（,uncompetitive inhibition,）,酶只有与底物结合后才与抑制剂结合,，形成的,三元中间产物不能进一步分解为产物，所以酶活性降低,（,这类抑制作用最不重要）。,反竞争性抑制作用常见于,多底物反应,中，而在单底物反应中比较少见。,非竞争,三种可逆抑制作用的比较,抑制剂,结构,抑制剂,结合位点,酶的,结合能力,增加底物,浓度的影响,Km,可逆,竞争性抑制,与底物近似,酶的,活性部位,不能同时,结合底物和抑制剂,解除,抑制效应,增加,可逆,非竞争性抑制,与底物不同,活性部位外的其他位点,同时结合,两者,无影响,不变,可逆,反竞争性抑制,与底物不同,活性部位外的其他位点,与底物结合后才与抑制剂结合,无影响,变小,3,、一些重要的抑制剂,不可逆抑制剂,有机磷化合物,与酶活性直接有关的丝氨酸上的,-OH,牢固地结合，从而抑制某些,蛋白酶或酯酶,。,（敌百虫、敌敌畏、农药,1605,等）,有机汞、有机砷化合物,与酶蛋白上的,-SH,作用，从而抑制,含,-SH,酶,活性。,（,对氯汞苯甲酸）,氰化物和硫化物,能与酶中的,金属离子,形成较为稳定的络合物，使酶的活性受到抑制。,重金属,Ag,、,Cu,、,Hg,等盐,能使大多数酶失活，加入,EDTA,可以除去。,烷化剂,往往含,一个活泼的卤素原子,，如碘乙酸、碘乙酰胺和,2,，,4-,二硝基氟苯等，使酶蛋白中的,SH,、,-NH,2,、,-OH,等发生烷基化而失活。,青霉素,抗菌素类药物，与,糖肽转肽酶,活性部位,Ser-OH,共价结合，使酶失活。,可逆抑制剂,在可逆抑制剂中最重要的是,竞争性抑制剂,。,例如：磺胺药、氨基叶酸等，,用增加底物浓度的方法可以减弱抑制作用。,本章总结,第一节 酶和酶工程概述,一、 酶及酶工程研究的意义,（一）酶的概念,（二）酶在生命体内的重要性,（三）酶的研究,二、酶学研究简史,三、酶工程,（一）酶工程的概念,（二）酶工程的的研究内容,（三）酶工程的分类,（四）酶工程的的研究方向,第二节 酶的分类、命名、组成、结构,特点和作用机制,一、酶的分类,二、酶的命名,（一）习惯命名,（二）系统命名,（三）酶的编号,三、酶的组成和结构特点,四、酶的作用机制,（一）酶的结构组成及活性中心,（二）酶作用专一性机理,（三）酶作用高效性机理,（四）影响酶高效性的因素,第三节 酶的催化特点和影响因素,一、酶的催化特点,（一）高催化效率,（二）强专一性,（三）可调节性,（四）不稳定性,二、影响酶活力的因素,（一）底物浓度,（二）产物浓度,（三）酶浓度,（四）温度,（五）,pH,（六）抑制剂,（七）激活剂,第五节 酶动力学和抑制作用,一、米氏方程,二、酶的抑制作用,（一） 抑制作用与抑制剂,（二）抑制作用的类型和特点,（三）一些重要的抑制剂,（四）酶抑制剂的应用,第四节 酶的活力测定,一、酶活力与酶反应速率,1,、酶活力,2,、酶反应速率,3,、酶活力单位,二、酶的比活力,三、酶活力的测定方法,作 业,1,、请论述酶的结构组成及其作用机制。,2,、试述影响酶催化作用的因素有哪些？,3,、酶抑制作用的类型及其特点。,