06_微生物生物净化与环境再生技术

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章,微生物生物净化与环境再生技术,生物净化与生物废料再生,1. 现代生物技术在降解非生物物质中的应用,2. 淀粉和其他含糖废液的利用,3. 木质纤维的利用,4. 利用微生物生产蛋白质,5. 污水的微生物净化,关于废物的处理,传统观点：,自然环境可以吸收净化-？,现 状：,工业高度发展，人口密度日益增高, 废物越来越多,21世纪面临的挑战：,1.如何处理、分解不断产生的大量垃圾。,2.如何除去过去几十年里积存在自然环境中的有毒物质。,现 在：,越来越多的人开始尝试用各种方法包括现代生物技术来清除环境中的污染物及有毒物质。,5.1 生物净化的定义,指利用微生物或者其它生物来除去环境中的生物垃圾和有毒物质的过程。,垃圾中含有很多有用物质，它们可以循环利用。,生物垃圾主要包括工农业生产过程中所产生的废弃物。,有毒废弃物给人们所造成的环境问题是,触目惊心,的,1985 全世界产生有毒废物五氯酚达50000吨。,1995 海上有5000吨石油原油泄漏。,传统处理垃圾及有毒废物的方法：填埋，焚烧，化学处理。但是填埋、化学处理容易造成土壤、水体二次污染，焚烧产生有毒有害废气,后果： 不能真正解决污染问题。,20世纪60年代，发现一些土壤微生物可以降解非生物物质微生物降解废物，为人类提供一种安全且成本低廉的清除有毒物质的途径。,降解废物的微生物多为假单胞菌,降解机制：多种酶同时作用。,编码酶的基因：,大多位于细胞大质粒上,有些在染色体上,还有的可能同时存在于质粒与染色体,这类微生物都可将未卤化的芳香族物质转化为,儿茶酚,或,原儿茶酸,，再经一系列氧化分解反应，把它们转化为,乙酰辅酶,A,和琥珀酸,或,丙酮酸和乙醛,，被生物体降解。,卤化芳香族化合物的降解速度与其所含的卤族原子数目成反比，去卤化反应由,双加氧酶,非选择性催化，在苯环上用羟基取代卤素。,海上浮油的清理是利用微生物降解非生物物质的一个重要方面。,苯,甲醛,甲酰犬尿,氨酸,儿茶酚,细菌将芳香族化合物转化成原儿茶酸的降解途径,原,儿茶酸,儿茶酚和原儿茶酸被转化成乙酰,CoA,和琥珀酸的降解途径,儿茶酚和原儿茶酸被转化成丙酮酸和乙醛的降解途径,5.1.1 生物降解途径的基因工程,1. 转移质粒：,将带有编码不同降解途径酶的基因的质粒导入同一受体菌中，若两质粒具有同源性，则可能组成一个大的具有多种功能的融合质粒。,例子：1. 20世纪70年代,Chakrabarty,等构建的,superbug,菌含有多种降解功能。,2. 低温降解甲苯的嗜冷菌的构建。,Superbug,菌的构建示意图,接合作用,Pseudomonas,putida,的,pTOL,质粒（降解甲苯）2040,生长,嗜冷菌（降解水杨酸）0,生长,嗜冷菌（降解水杨酸和甲苯）0,生长,pTOL,质粒（降解甲苯）,2、改变基因,研究实例：对,pWWO,质粒的甲苯/二甲苯代谢途径的研究,该质粒携带的与烷基苯降解相关的活性而受到很大的重视。,通过,DNA,重组技术、基因突变以及适当的选择过程，可在细菌的有机物降解途径中加入新的功能，用同样的方法也可得到能同时分解多种污染物的菌株。,pWWO,质粒编码与“间位开裂”途径相关的12种不同的基因，同时能使带有该质粒的假单胞菌具有利用不同的烷基苯作为碳源的能力；,在,pWWO,中，与甲苯/二甲苯代谢途径相关的基因处在同一个操作子中，即在,P,m,启动子控制下的,xyl,操作子。,P,m,启动子受到,xylS,基因产物的正调控，,xyl,基因则可以被多数甲苯/二甲苯途径的底物所激活，如苯烷、三甲基苯烷。,带有,pWWO,质粒的菌株可以将4-乙基苯分解为,4-乙基儿茶酚,，后者可以在培养基中积累。4-乙基儿茶酚通过使,xylE,基因的产物,儿茶酚-2,3-双氧化酶,失活，使得4-乙基儿茶酚不能再被进一步降解。,与其它苯烷不同的是，4-乙基苯不能激活,xylS,蛋白，所以当只有4-乙基苯存在时，该操纵子的,Pm,启动子不能被激活。,该质粒用于环境中烷基苯类物质的降解情况：,（,1,）如果环境中只存在甲苯,/,二甲苯类，而不存在,4-乙基苯，则该操纵子可发挥完全活性而使甲苯,/,二甲苯完全降解；,（,2,）如果仅存在4-乙基苯，由于,Pm,启动子不能被启动，不能发生降解；,（,3,）但是，如果环境中同时存在甲苯,/,二甲苯,/,4-,乙基苯，,P,m,启动，,4-,乙基苯只能发生部分降解，形成,4-,乙基儿茶酚，后者可抑制,xylE,基因产物儿茶酚,-2,3-,双氧酶的活性，使整条代谢途径不能全部完成。,pWWO,上与甲苯/二甲苯代谢途径有关的基因,4-乙基苯,4-乙基儿茶酚,儿茶酚2，3-双氧酶,问题：,1）怎样克服4-乙基儿茶酚对其进一步降解,反应的抑制作用？,2）怎样用4-乙基苯作为诱导物诱导这个操,作子的转录？,构建新的质粒,卡那，氨苄双抗筛选,硫酸乙酰甲烷诱变,解决了诱导问题,如何解决,儿茶酚2，3-双氧酶失活问题,突变的,xylS,基因,卡那霉素抗性质粒,pWWO,质粒,转化,假单胞菌,Pseudomonas,不被4-乙基儿茶酚所抑制、突变的儿茶酚-2,3-双氧化酶,4-乙基苯卡那霉素,诱变剂,生长,以4-乙基苯为唯一碳源，含有卡那霉素和诱变剂硫酸乙酰甲烷的平板,三氯乙烷的降解,三氯乙烷是土壤和地下水中最常见的污染物之一，是一种致癌物，可在环境中滞留几年。,恶臭假单胞菌,（,P.,putida,）,及其他一些能降解甲苯类芳香族化合物的细菌能分解三氯乙烷。,甲苯双氧化酶必需，该酶需四个基因参与表达。,四个基因连到,tac,启动子之后，在,tac,启动子作用下经,ITPG,诱导可以在大肠杆菌中表达。,生物降解的活性可通过将特异性的酶转移至最适宿主而得到提高。,5.1.2 利用微生物降解农药,农药的广泛使用：,农作物产量提高,农药污染越来越严重,80农药残留在土壤中,有机氯杀虫剂,多种具有农药降解能力的微生物,影响农药降解的因素,农药的化学性质,难度：氯代烃类二硝基苯三甲基取代氧基脂肪酸脂肪酸,环境湿度,难度：润湿环境干燥环境,化学农药的微生物降解途径,农药微生物降解的途径：,1.矿化作用,通过微生物的代谢作用，最终完全降解为,CO,2,和,H,2,O。,2. 共代谢作用,微生物将农药转化为可代谢的中间产物，从而从环境中清除残留的农药。,化学农药的微生物降解结果,1.解毒作用,有毒 无毒,2.结合作用,农药的微生物代谢产物与未被代谢的农药相结合，形成更复杂但是无毒的物质，如形成有机酸等。,3.,改变毒性谱,4.,活化作用,无毒或低毒 有毒和剧毒,5. 消效作用,潜在的有毒农药 无毒物质,5.1.3 利用绿色植物清除污染物,能量来自太阳，经济。,但见效慢，且所处环境酸度，盐度在植物耐受范围之内。,例：,除去土壤中的镉,Cd,Sebertia,accuminata,可以在体内富集镍（,Ni）,达干重的25,野生植物在应用中的局限：,2. 具有吸收污染物能力的植物生长缓慢,3. 这类植物多属于稀有植物，难以获得，且对这类植物生长发育特点知之甚少,1. 每种植物只吸收一种污染物,植物消除化学污染的发展,从植物中筛选突变体。如：一种突变的矮牵牛可吸收比野生型多10100倍的铁离子；,利用植物基因工程获得转基因植物。如：转金属硫蛋白基因的植物；,从传统的消除无机物污染发展到消除有机物污染：已获得降解三硝基甲苯(,TNT,),，,三氯乙烷(,TCE),的转基因植物。,5.2 淀粉和其他含糖废液的利用,制糖工业和食品加工业的各种废渣、废液中含有淀粉可用来生产细菌蛋白或作为饲料。,制糖工业产生的废蜜可用于生产食用或 药用酵母。,还可用废液、废渣生产果糖和乙醇。,还可用废液、废渣生产其他种类真菌如白地霉，禾本科镰孢菌等。,先分解为低分子量的物质。,主要酶：,-,淀粉酶、葡萄糖化酶、葡萄糖异构酶。,主要步骤：, 胶化：,通过高压熏蒸使淀粉转变成胶状物质,水解反应：,在,-,淀粉酶的作用下，,-,1,4-糖苷键发生水解，形成低分子量多糖。一般要求在5060下进行。,糖化：,在葡萄糖化酶的作用下，低分子量多糖转变成葡萄糖，即多糖的完全水解。,5.2.1利用淀粉和其他含糖废液生产果糖和乙醇的常规方法,淀粉生产商品果糖和乙醇的过程,胶化,水解反应,糖化反应,淀粉,葡萄糖,高压熏蒸,-,淀粉酶,葡萄糖化酶,葡萄糖异构酶,果糖,降温,酵母发酵,乙醇,淀粉的酶解,直链淀粉,麦芽糖,糊精,葡萄糖,葡萄糖,淀粉酶,淀粉酶,淀粉酶,支链淀粉,极限糊精,麦芽糖,极限糊精,麦芽糖,葡萄糖,葡萄糖,葡萄糖,淀粉酶,淀粉酶,葡萄糖淀粉酶,葡萄糖淀粉酶,淀粉酶随机水解,-1，4,糖苷键,淀粉酶从末端水解,-1，4,糖苷键,葡萄糖淀粉酶水解,-1，3、-1，4,和,-1，6,糖苷键,工业用,淀粉酶,来源于,Bacillus,amyloliquefaciens,葡萄糖淀粉酶,来源于,Aspergillus,niger,5.2.2 利用,DNA,重组技术对果糖和乙醇生产方法进行改进的几种假设,1. 利用生长在廉价培养基的是重组后的微生物大量生产所需的酶，这比直接从组织中提取成本低。,2. 利用,-,淀粉酶的突变体进行工业生产。,3. 改变,-,淀粉酶和葡萄糖淀粉酶的基因使它们具有同样的最适温度和最适,PH,值。,4. 寻找和利用,DNA,重组技术获得能够分解粗淀粉的酶,5. 寻找一种可发酵的生物，使之能够分泌葡萄糖淀粉酶。,5.2.2.1,-,淀粉酶基因的改造,plasmid,酶切,酶连,酶切,转化,抽提,涂皿,碘蒸气,透明斑,结果表明：,-,淀粉酶是在自身启动子作用下转录的，且该基因上带有分泌信号,解决办法,：,Aspergillus,awamori,Saccharomyces,cervisiae,+,质粒,葡萄糖淀粉酶基因,该酵母既能产生葡萄糖淀粉酶又能发酵生产乙醇,含有酵母烯醇化酶基因,ENO1,的启动子和转录中止信号,1. 除去烯醇化酶基因,ENO1,启动子中的一段175,bp,负调控区域,2. 删除质粒中酵母,ars,再加入一段与酵母染色体具有同源性的,DNA，,将完整的葡萄糖淀粉酶基因整合到酵母染色体的特定位置使其稳定遗传,3. 选用耐受高浓度乙醇的受体菌,得到两株新的酵母株系，具有更强的淀粉水解能力，同时又能使可溶性淀粉发酵,5.2.2.2 木糖/葡萄糖异构酶基因的改造,木糖/葡萄糖异构酶即为葡萄糖异构酶,D-,葡萄糖转化为,D-,果糖仅为其副反应。,该酶定位于细胞内，制备时具有较高的成本。,葡萄糖转化果糖的异构过程是一可逆反应，温度越高，果糖含量越高。因此，耐热的木糖/葡萄糖异构酶具有较大的开发价值。,嗜热菌,Therrnus,thermophilus,能产生一种木糖/葡萄糖异构酶,它在高温下非常稳定，但酶产量不高。,已分离该酶基因，分别在大肠杆菌和芽孢杆菌中表达，结果表明，在短杆菌中的酶活是出发菌的1000多倍；,对酶底物特异性的改进。如定点诱变嗜热菌,Clostridium,thermosufurogenes,葡萄糖异构酶的两个,AA(139,位的,Tyr,Phe,186,位的,Val,Thr,)，,提高转化效率。,5.2.2.3 寻找新的工业发酵用菌,目前工业发酵乙醇全用酵母。运动发酵单胞菌,（,Zymomonas,mobilis,）生成乙醇的速度更快,运动发酵单胞菌为,G,-,杆菌，能通过发酵将葡萄糖、果糖、蔗糖转化为乙醇，而且产量很高。但是，该菌存在如下一些限制因素：,1、可被利用的碳源物质十分有限；,2、外源载体往往在该菌内极不稳定；,3、该菌对多种抗生素具有抗性。,5.3 木质纤维的利用,木质纤维经化学和生物学处理，可转化为各种各样的无污染的工业原料。,木质纤维分类：,初级纤维：棉花、木材、干草等。,农业废弃物：稻草，秸秆、甘蔗渣等,日常生活的废纤维产品：废纸等,5.3.1 木质纤维的成分,1. 木质素,2. 半纤维素,3. 纤维素,人们已经将很多化学和酶学的方法用来处理木质纤维，但迄今为止成功的方法很少。,结构中没有任何规则的重复单元或易被水解的键,理化性质由合成过程中的最后一步决定，而且是随机的，造成了其分子的不规则性,它的存在使植物具有一定硬度，能够抵抗机械压力和微生物侵染,半纤维素是由五碳糖和六碳糖组成的短链异源多聚体,可分为：,木聚糖,甘露聚糖,阿拉伯半乳聚糖,纤维素,构成植物细胞壁的主要成分,由葡萄糖通过,1，4,糖苷键连接而成的直链多聚物，通常一条链中可含10000多个葡萄糖分子。,5.3.2 原核生物中纤维素酶基因的分离,许多细菌和真菌都能在多种酶的共同作用下水解纤维素，这些酶统称纤维素酶。,纤维素酶是一种被称为纤维小体的多功能复合蛋白的一部分，位于细胞外表面。,纤维素酶含有下列几种酶：,葡聚糖内切酶：,催化,-,1,4-糖苷键的水解,葡聚糖外切酶：,从纤维素缺刻部分的非还原末端开始降解,纤维素分子，产物为葡萄糖、纤维二糖和纤维三糖,纤维素水解酶：,从纤维素分子的非还原端切去10个以上的葡萄,糖残基,-,葡萄糖苷酶：,将纤维二糖或纤维一糖转化为葡萄糖,葡萄糖苷酶,野生的微生物降解纤维素速度很慢，人们试图通过基因工程方法得到具有更高纤维素酶活性的微生物。,采用下列分离方法，人们从原核生物中克隆了编码葡萄糖内切酶的基因。,基因文库,大肠杆菌,抗性平皿,含,CMC,37培养,刚果红染色,NaCl,接种,刚果红可以选择性地与高分子纤维素结合并显示红色，而与低分子量的多糖的结合能力较弱，显黄色。,利用上述技术，人们从,Streptomyces,、Clostridium、,Thermoanaerobacter,、,Cellulomonas,、,Fibrobacter,和,Bacillus,中成功地分离出了编码葡聚糖内切酶的基因。,免疫学方法筛选带有重组的葡聚糖内切酶基因的克隆。,5.3.3 真核生物纤维素酶基因的分离,差异杂交法,聚丙烯酰胺凝胶,兔网织红细胞系统和麦胚细胞系统,5.3.4 纤维素酶基因的改造,纤维素酶的结构可分3个区域：,催化区域,、,富含,Pro、Ser、Thr,残基的铰链区,、,纤维素结合区域,。,催化和结合区域可独立发挥功能。人们可以仅克隆纤维素结合区域作为融合蛋白编码序列的一部分。另一部分基因则编码商品蛋白。,融合蛋白可以结合在纤维素柱上得到纯化。,多数纤维素酶基因最初都是在大肠杆菌中克隆和表达的。,现在已转化到酿酒酵母和,Zymomonas,mobilis,中。,工业上应用微生物由纤维素生产乙醇的方式,直接法：,同一微生物完成纤维素的水解、糖化和乙醇发酵,热纤维梭菌：,Clostridium,thermocellum,副产物较多,间接法：,一种微生物水解纤维素并糖化，另用酵母进行乙醇发酵,成本较高,同时糖化发酵法：,利用一种可产生纤维素酶的微生物和酵母在同一容器中连续进行纤维素的糖化和发酵,工业上的两个难题：,酶的成本较高,前处理成本较高,解决办法：,1.生物技术对产纤维素酶的微生物进行改造,2.固定化技术,3.改进工艺，减少中间产物对酶的抑制,4.开发能直接作用于天然高聚合纤维素的微生物,5.4 利用微生物生产单细胞蛋白(,SCP,),人口急剧增长，食品不足，蛋白质资源短缺；,工农业生产不断产生大量的有机废弃物，其中包含着大量糖质、淀粉、纤维素、半纤维素等可再生性生物资源；,利用微生物将废弃物质转化为蛋白质，提高资源利用率，消除环境污染，改善生态环境。,5.4.1 微生物蛋白的营养价值,微生物菌体粗蛋白含量（占干重）：,细菌 4080、酵母3560、丝状真菌1550,氨基酸组成：,含,S,氨基酸稍不足外，其他丰富,。,含多种维生素，,如,B,2,、B,6,、 ,胡萝卜素及麦角固醇等，但,B,12,稍不足。,在所含的矿物质中，,磷、钾丰富，但钙含量较少,。,玉米,0.15,玉米1酵母,0.73,玉米5酵母,2.11,因此，若在微生物蛋白中添加,Met、,维生素,B12,和,补充,Ca,质，则可获得与鱼粉相当的营养效果。,猪增重量/蛋白质消耗量,（,蛋白质效价）,单细胞蛋白：,single cell protein, SCP,是指从纯培养的微生物细胞中提取的总蛋白质。,潜在的应用：,作为人类食品；,作为畜用饲料；,作为工业原料（微生物培养基成分、合成纤维的,亲水剂、各种填料、增稠剂、乳化剂及稳定剂等）,单细胞蛋白的优点：, 微生物生长快，蛋白产量高；,0.5,kg,牛肉/1000,kg,酵母蛋白,单细胞藻类：750吨蛋白质（干重）/年亩，,而大豆：5075吨蛋白质（干重）/年亩，,玉米：1530吨蛋白质（干重）/年亩。, 微生物蛋白含量高，氨基酸种类全，且富含维生素；, 微生物的培养不受季节、气候和地区的限制，易于实现工业化生产。,缺陷：,SCP,中核酸含量高；,毒性物质存在的可能；,人类消化较慢；,目前比其它来源的蛋白（如大豆蛋白）昂贵。,5.4.2 单细胞蛋白的生产,单细胞蛋白的生产可通过细菌、酵母、真菌、藻类和放线菌来进行；,德国首先利用酵母来生产用作汤和调味的加厚剂；,1973年，各大石油公司利用石油或者副产品生产,SCP，,后因成本变高而放弃；,1979年，英国帝国化学公司,ICI,连续甲醇发酵法：利用食甲基嗜甲基菌（,Methylophilus,methylotrophus,）,用甲醇作为碳源，建立了50000,T,年产的工厂，拥有世界上最大的连续发酵器，但还是由于成本高而无法大规模生产。,充分利用多种不同废物。,选择菌种的原则：,产物蛋白要富于营养、可口、易消化、无毒、微生物易于培养，便于收集。,5.4.3 利用木腐性食用菌生产蛋白,解决人们对单细胞蛋白食用的疑虑。,传统方式农业式栽培：劳动强度大、难以实现自动化、机械化。,液体深层发酵法：高效自动化，但难以获得子实体。,虽然研究测定表明，菌丝体的营养成分与子实体相当，但是菌丝体并不能作为食品来投放到市场，因此还需要经过进一步加工成其它形式的食品或者作为食品添加剂才能投放到市场。,5.5 污水的微生物净化,水是人类赖以生存的最宝贵的资源。,水不是取之不尽、用之不竭的！今天，水资源枯竭、水质恶化是摆在全人类面前的一个严重问题。,污水的分类及特点：生活污水， 工业污水。,不同来源污水降解难易程度不同。,5.5.1 用微生物处理污水的机制,通过微生物的代谢活动，将污水中的有机物分解，从而达到净化污水的目的。,天然水体的自净化现象主要是细菌,自净化有一定限度，高温不利于自净化,5.5.2 可用于污水处理的微生物,包括3类：需氧微生物、厌氧微生物、兼性厌氧微生物,要通过基因工程的手段选育高效菌株,-粘乳产碱杆菌(,Alcaligenes,viscolactis,)S-2,和裂腈无色杆菌(,Achromobacter,nitrilocates,),分解含腈废水，腈去除率可达90以上;,-,芽孢杆菌（,Bacillus,）,和气杆菌（,Aerobacter,）,可降解三硝基甲苯（,TNT）；,-,在污水中生长的固氮菌：污水往往有机质含量高，但缺少,N、P,等无机元素提高含,N,量；,-放线菌属,(,Actinomyces,),和假单胞菌属(,Pseudomonas,),很有前途的污水处理菌种,污水净化与废物利用合而为一,绿色木霉,食品和林业的纤维素,多糖,酵母菌,食品工业废水,酒精,5.6 废气的微生物净化,工业尾气的污染日益严重，传统的处理方法是通过燃烧处理的物理方法进行，其缺点是：,（1）高能耗、高成本；,（2）由于可能造成二次污染。,废气的生物净化是指利用微生物来分解废气中的有机物，产生氧气、水和其它代谢产物的净化方式。,（1）可被微生物迅速降解的废气，包括乙醇、酮、醛类、,有机酸和有机氮等；,（2）可被微生物缓慢降解的废气，包括酚、烃、氯代有机物,（3）微生物降解及其缓慢的废气，卤代烃、多聚芳香烃等,5.6.1 生物膜法,将可以降解废气的微生物固定化于生物膜上，然后令加温后的废气以115,cm/s,的速度通过滤膜，达到净化的目的。,优点：设备简单、操作方便、成本低；,缺点：处理速度慢，难以大规模应用。,5.6.2 循环式净化法,微生物随着培养液在废气箱内流动，因为方便于对反应体系的温度、,pH,值等加以检测和调整。,S,再,见,