DNA和质粒抽提

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,DNA,抽取和质粒,DNA,制备,第一部分,DNA,提取总论,一、提取,DNA,总的原则：,1 保证核酸一级结构的完整性；,2 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类 分子的污染应降低到最低程度；,3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；,4 其他核酸分子，如,RNA，,也应尽量去除。,二、样本来源：,理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取,DNA,样本选择取决于,试验目的,全血是基因组提取最常见的样本,血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的,60%,以上,DNA,提取前样本采集、预处理和保存：,（一）全血,1.,抗凝剂,EDTA-Na2,或枸橼酸钠,作为抗凝剂,不宜使用肝素,抗凝剂处理血,肝素,柠檬酸*,EDTA*,-80,保存,2,个月，第,10,天收率,90%,4,第四天收率,90%,第,10,天提取效果差,第十天收率,85%,室温,提取效果差,第四天收率,90%,第十天提取效果差,mRNA,逆转录后,RT-PCR,结果（0、3、6个月）,A B C D,（二）血浆和血清,血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因的检测中,血浆,DNA,又称为循环,DNA,，是一种无细胞状态的胞外,DNA,，主要是游离的单链、双链,DNA,或,DNA-,蛋白质的混合物,它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景,血浆,DNA,成分的来源分为内源性和外源性两个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液的核酸是外源性血浆,DNA,最重要的成分,血浆,DNA,内源性循环,DNA,外源性循环,DNA,自身基因组来源,DNA,入侵的病毒、细菌等病原体,死亡细胞,活细胞释放,（三,）,体液,尿液、胸水、腹水和脑脊液等标本离心后取沉淀提取体液中细胞的核酸,对释放入体液中的病毒或细菌的游离核酸，采用超高速离心或体液浓缩后再提取核酸,（四）分泌物,（以痰液为例）,痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，,深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前应先漱口，以避免混入大量的口腔脱落的上皮细胞和唾液等影响检测结果,结核分枝杆菌的检测，可以用,NaOH,液化痰液去除粘液和蛋白质,；,非结核分枝杆菌的核酸，使用生理盐水后取上清液,痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率,三、,DNA,的收率,样本类型,基因组,DNA,收率,20,mg,肝脏组织,8,g,100,mg,豆苗,10,g,100,l,全血,2,g,2,10,6,培养细胞,10,g,四、,DNA,提取的基本步骤,1,、,核酸的释放：,破裂细胞 释放核酸,机械法与非机械法,（非机械法中,溶胞法,是应最广泛的方法）,各种组织细胞破碎方法,细胞破碎方法,应用,机械法,1匀浆法,机体软组织,2捣碎法,动物韧性组织,3研磨法,细菌、酵母,物理法,1超声法,细胞混悬液,2反复冻融法,培养细胞,3冷热交替法,细菌、病毒,4低渗裂解,红细胞,化学法,1有机溶剂,细菌、酵母,2去垢剂,组织、培养细胞,3酶解法,细菌、酵母,破裂细胞 、释放核酸,2、核酸的分离与纯化：,将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其,他物质分离,非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂,类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液,3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤,沉淀可去除部分杂质与某些盐离子,加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）,少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤,4、,DNA,鉴定,DNA,的鉴定,浓度鉴定,纯度鉴定,完整性鉴定,浓度鉴定,1）紫外分光光度法：测定,DNA,在,A,260nm,的光吸收值。,如计算,DNA,浓度,A,260,稀释倍数50,g/ml,紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25,ug,/ml,的核酸溶液。,(,A,值等于1时，相当于50,g/ml,双链,DNA， 40,g/ml,单,链,DNA,或,RNA，20,g/ml,单链寡核苷酸）,各种碱基的紫外吸收光谱,2）荧光光度法,荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。,适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5,ng,）,EB,与,DNA,的结合,500,l,全血提取的基因组,DNA,电泳,动物组织提取基因组,DNA,纯度鉴定,紫外分光光度法：,在260,nm,和280,nm,处测定,DAN,溶液的光吸收，纯的,DNA，,低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有,RNA,的残留量。,A,260,与,A,280,之比应在1.80；纯的,RNA A,260,与,A,280,之比应在2.0。,A260/A280,比值是纯度检测的重要指标。,完整性鉴定,凝胶电泳法：,基因组,DNA,电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；,总,RNA,电泳，观测各条带的含量，提示是否存在,RNA,降解；如加样槽中存在条带，可能是,DNA,污染。,5、核酸的贮存,DNA,保存,1）短期贮存：,4或-20存放于,TE（,tris,和,EDTA）,缓冲液中。,TE,缓冲液的,PH,与,DNA,贮存有关，,PH,为8时，可减少,DNA,脱氨反应，,PH,低于7.0时,DNA,容易变性。,2）长期贮存：,TE,缓冲液中-70保存数年；在,DNA,溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。,第二部分 基因组,DNA,的分离与纯化,一、,DNA,样品准备,常见的标本：,血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等,生物组织：,最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存, 70或液氮,二、,DNA,提取,（一）酚抽提法：,先用,EDTA、 SDS 、,蛋白酶,K,破碎细胞，消化蛋白，然后用,pH8,的,Tris,饱和,酚或酚-氯仿抽提,DNA，,最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获,DNA,大小为100150,kb。,DNA,酚抽提法示意图,主要试剂的作用：,EDTA：1,二价金属螯合剂，抑制核酸酶；,2 降低细胞膜的稳定性,SDS,的作用：,1 溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂,溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸,释放出来,3 对,RNA、DNA,酶有抑制作用,4 与蛋白质形成,R-O-SO3 .R,蛋白质复合物，使蛋白质变性,蛋白酶,K：,水解蛋白质的作用，消化,DNA,酶和细胞中的蛋白质,蛋白酶,K,与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能,力，而且在,SDS、EDTA,存在时仍保持较高活性，可,同时使用,苯酚的特点：,蛋白质强变性剂、抑制,DNA,酶活性,苯酚溶于有机溶剂，微溶于水,提取,DNA,前苯酚用,Tris,-,Hcl,饱和，防止吸收过多,DNA，,降低,DNA,的损失率,氧化苯酚会破坏,DNA,为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于,DNA,的分离？,苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于,DNA,分离，会使磷酸二酯键断裂，造成,DNA,降解。,氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用,Ttis,-,Hcl,饱和酚，并调节至中性。,PH8.0,的,Tris,溶液可以似的抽提出的,DNA,进入水相，减少在蛋白质层滞留。,在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。,DNA,的沉淀,1）无水乙醇沉淀,沉淀前往往加入,NaCl,等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。,无水乙醇可以吸收分子之间的水，使,DNA,沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少,DNA,沉淀析出过程释放热量对,DNA,的损伤。,2）异丙醇沉淀,除了使,DNA,沉淀外，还可以溶解少量的小的,RNA,分子,（二）,甲酰胺解聚法：,破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与,DNA,的结合，再透析获得,DNA。,高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与,DNA,的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤,甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的,DNA,样品。可得,DNA 200kb,左右。,（三） 玻璃棒缠绕法：,用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或,U,型玻璃棒在界面轻搅，,DAN,沉淀液绕于玻棒。生成,DNA,约80,kb,DNA,玻棒缠绕法示意图,（四） 表面活性剂快速制备法：用,Triton X-100,或,NP40,表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶,K,或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。,二、,DNA,的浓缩,1、固体聚乙二醇（,PEG）,浓缩：用透析袋 外敷,PEG,至合适量,2、丁醇抽提浓缩：,DNA,溶液中水可分配到正丁醇或仲丁醇，但,DNA,不会。因此重复几次可显著减少,DNA,体积,三、,DNA,回收,主要是从电泳中分离回收,DNA,片段,回收原则：尽量提高回收率,去除回收,DNA,样品中的污染物,（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收,DNA,片段,（一） 从琼脂糖凝胶中回收,DNA,片段,1.,二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法,2.电泳洗脱法,3.冷冻挤压法,4.,低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法,（一） 从琼脂糖凝胶中回收,DNA,片段,电泳到,DEAE-,纤维素膜 ：,DEAE,是一种阴离子交换纤维素，可以吸附带有负电荷的,DNA,分子,在所需条带前插入,DEAT-,纤维素膜，继续电泳至条带,DNA,都到膜上，取出洗下,500,bp,-5kb,的,DNA,片段回收率较好，纯度高。,但不适用于分子量超过10,kb,和单链DNA,透析袋电洗脱 ：,切下条带的琼脂糖凝胶，放透析袋内，加缓冲液后继续电泳，,DNA,出胶后进行抽提,DNA,回收。,低熔点琼脂糖凝胶：,切下胶，加热到65熔化胶，然后抽提回收,DNA。,方法：有机溶剂提取法、玻璃珠洗脱法和琼脂水解酶等。,琼脂水解酶：将含,DNA,的凝胶进行消化，琼脂糖水解成二糖，释放,DNA，,后使用酚抽提方法回收,DNA,（二） 从聚丙烯酰胺凝胶回收,DNA,片段,聚丙烯酰胺凝胶中回收,DNA,的标准方法是压碎与浸泡法。虽费时但操作简单，是小片段,DNA,回收的较好方法。,至今尚无一种方法既能有效回收,DNA,大片段或微量的,DNA,片段，又能同时回收几种,DNA,片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂。,DNA,提取试验中常遇到的问题,基因组,DNA,收率较低或无基因组,DNA,样本材料太少,细胞破裂不够充分，,DNA,释放不完全,离心力偏小,两相分离不完全 ,DNA,降解的原因,样本不够新鲜，采集材料过陈旧,样本本身存在大量,DNA,酶,提取,DNA,的生物活性差的原因？,提取的基因组,DNA,盐浓度过高,基因组,DNA,中乙醇未清除净,基因组,DNA,中可能存在其他抑制因素,提取基因组,DNA，,有时加入蔗糖的原因,加入多糖，保护,DNA,长度,质 粒,DNA,制 备,plasmid,extraction,质粒简介,质粒,(,plasmid,),是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状,DNA,分子,其大小范围从,lkb,至200,kb,以上不等。,已经在形形色色的细菌类群中发现质粒.,这些质粒都是独立于细菌染色体之外进行复,制和遗传的辅助性遗传单位。,Chromosome DNA genome,Plasmid,DNA,质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值，而质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术,质粒特性,1. 分子相对小,2. 含有高效的自主复制成分,3. 不相容性,(incompatibility),4. 转移性,5. 选择的标记,(selective markers),6. 限制性内切酶单一切口,质粒的结构特点,分子量相对较小,共价闭合分子,双链环状结构,具有更强的抗切割和抗变性能力,超,螺旋,DNA,分子,线性,DNA,分子,半开环,DNA,分子,Plasmid,vectors,表达载体,载体含有,tac,启动子、,Lac,操纵基因、,SD,序列、,Lac I,阻遏蛋白基因等,Exprssion,vector,细菌收集,纯化质粒,DNA,细菌培养,细菌裂解,质粒,DNA,的提取和纯化,质粒,DNA,的提取和纯化,一、细菌的培养,(bacterial culture),l,先分离单个菌落，接种到含少量适当抗生素的培养基中扩增，随着细菌的生长，质粒,DNA,也在自主复制。,对于松弛型质粒，由于它的复制在一定程度上不受到宿主细胞的控制，故在细菌对数生长后期，加入氯霉素（,chloromycetin,）,抑制宿主蛋白质的合成和染色体,DNA,的复制。质粒,DNA,的复制不受影响而大量扩增,l,所以使用氯霉素的主要目的，是在不减低质粒产量的前提下，减少细菌的培养体积和细菌的数量,有时质粒在细菌中的扩增状况很差，常是由于质粒携带外源基因或质粒分子量过大所致。,二、细菌的收集,(bacterial collection),细胞生长过程中，排出大量代谢产物，为了提高质粒,DNA,的纯度，离心弃上清，细菌沉淀最好用,STE,或生理盐水悬浮，漂洗,l-2,次，离心管壁上的液体也应该仔细去除干净。,三、细菌裂解,细胞的裂解方法很多，如去污剂法，沸水热裂法、碱变性法，有机溶剂法和溶菌酶法等。不同方法各有利弊，一般要根据质粒性质、宿主菌的特性及后继的纯化方法等多种因素综合后加以选择,。,质粒提取的方法,碱裂解法,(Alkaline ),煮沸裂解法,SDS,裂解法,其他,质粒,DNA,提取方法的选择,l,常用的煮沸法，碱法,SDS,法均可获得较满意效果至于有人采用碱法提取小量细菌培养物的质粒， 用煮沸法或,SDS,法进行质粒,DNA,的大量分离，只是各个实验室的习惯问题.,l,选择哪种方法制备质粒,DNA，,应考虑以下因素：,1菌株类型（,type）,2质粒的大小(,size),3细菌染色体,DNA,变性条件强弱的控制,(,denaturation,condition),质粒,DNA,的小量制备 2-5,ml,质粒,DNA,的大量制备 500,ml,大质粒（,15,kb）,的处理方法：,采用温和处理方法，使用蔗糖、溶菌酶、,EDTA，,后再,使用,SDS,裂解，使,plasmid,损伤减少,小质粒（,15kb）,的提取。但有一部分质粒,DNA,会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。,（四）其它方法,2、牙签少量制备法,1、 小量一步提取法,1、 小量一步提取法,直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，然后离心去除大部分蛋白质和染色体,DNA，,最后从上清液中回收质粒,DNA。,本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。,（二）牙签少量制备法,用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒,DNA。,由于制备的质粒,DNA,有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。,质粒,DNA,的纯化,.,CsCl,-EB,法,.聚乙二醇沉淀法,.柱层析法,EB,CsCl,密度梯度离心法,EB,插入相邻的碱基之间，降低了,DNA,的浮力密度，但超螺旋的,DNA,结合,EB,浮力密度降低较小，仅有0.085,g/cm,3,。,CsCl,可以用丁醇抽提，透析除去。纯度可达100%。,超速离心将介质,CsCl,形成一连续的密度梯度，在过量,EB,存在下，蛋白质的密度最小位于最上层；,RNA,密度最大沉于管底；,DNA,位于中间，由于不同结构的,DNA,与,EB,结合度不一致，因此密度下降不一致，故将线性、开环、闭环的,DNA,区分开。,EB,CsCl,密度梯度离心法示意图,l,转基因动物，真核细胞转染及,DNA,外切酶酶切缺失等实验，对闭合环状双链,DNA,的要求较高，一般还是用超速离心法纯化质粒。,对于,DNA,片段酶切回收，内切酶图谱分析、细菌转化、亚克隆及探针放射性标记等实验，直接用小量或中量提取的,DNA,样品，并不需要超速离心纯化，一般可满足实验要求。,2 聚乙二醇沉淀法,分级沉淀，首先利用,LiCl,沉淀大分子,RNA，,用,Rnase,酶消化小分子,RNA；,在利用乙二醇选择性沉淀大质粒,DNA，,再利用酚-氯仿抽提。,方法简单实用，但是不能区分环状或开链质粒,DNA,3 柱层析法,以硅基质作为填充层析柱的树脂，在多盐的条件下，,DNA,与硅基质可逆性的结合进行纯化。,多盐造成磷酸二酯骨架脱水，通过暴露的磷酸盐残基与硅基质结合，然后用50%的乙醇洗去,RNA,和糖类物质，再加入,TE,或水，离心洗脱。,RNA,的分离与纯化,RNA isolation and purification,每个细胞的,RNA,量约为10,-5,g,80%-85%,rRNA,10%-15%,tRNA,1%-5%,mRNA,其他,RNA：,hnRNA,、,snRNA,、,snoRNA,组织材料,起始样品量,Total RNA,提取量,blood,1ml,1520,g,lecukocytes,1,10,7,个,约,100,g,Liver tissue,1g,约,5000,g,Culture cells,1,10,7,个,约,100,g,Renal tissue,1g,约,3000,g,Skeleton tissue,1g,约,1500,g,Cerebral tissue,1g,约,1500,g,一、关于,RNase,酶,RNA,易被,RNase,水解，,RNase,除胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中,RNase,具有水解核糖残基和磷酸二酯键,RNase,分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定，去除变性剂后，,RNase,的活性又可恢复。,Rnase,不需要二价阳离子激活,去除,RNase,的污染及强有力地抑制其活性是,RNA,制备成功与否的关键。,必须在总,RNA,提取分离的,最初阶段,，尽可能地灭活胞内,RNase,的活性。,1.内源性,RNA,酶（,intrinsic,RNase,）,2.外源性,RNA,酶,(extrinsic,RNase,),主要来源：,被污染的缓冲液,细菌或微生物污染，高压不能去除,RNA,酶，,必须丢弃,自动移液装置,3.实验室采取避免,RNA,酶污染的措施,设置专门,RNA,移液装置,小份保存缓冲液,设置专门的,RNA,电泳装置,准备溶液或缓冲液时，使用无,RNA,酶的器皿、,DEPC,处理水等,分离,RNA,过程中使用,RNA,酶抑制剂,1. 变性剂,(denaturant),选择性地使用,RNase,的变性剂,（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）,使用,蛋白酶,K(,proteinase,K),使用阴离子去污剂如,SDS、,十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠,二、,RNA,酶抑制剂和变性剂,胍类变性剂,(,carbamidine,),：胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂。,蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍和盐酸胍，使蛋白质转换成随机卷曲状态。,盐酸胍抑制,RNA,酶作用强，变性作用较异硫氰酸胍弱。异硫氰酸胍自身可形成氢键，在还原剂存在下断裂氢键。,联合使用,RNase,的特异抑制剂（如,RNasin,与,DEPC,等）能极大地防止内源性,RNase,对,RNA,的降解。,2.,RNA,酶抑制剂,(,RNase,inhibitor),（1）,DEPC（,焦碳酸二乙酯）,高度活化的烷基化试剂，破坏,RNA,酶活性。用来灭活缓冲液或器皿中的,RNA,酶。,O,C-CH,2,-CH,3,O,C-CH,2,-CH,3,O,=,=,DEPC,水制备：0.1%,DEPC,在37,C,处理1,h，,并高压灭菌15,min。,玻璃制品和塑料制品应浸泡在0.1%的,DEPC,水溶液中， 37,C,处理1,h,或室温下过夜。,DEPC,非选择性的修饰蛋白质和,RNA，,且与一些缓冲液不相容，故在分离和纯化,RNA,的过程中不使用,DEPC。,（2）,RNA,酶的蛋白抑制剂,许多,RNA,酶可以与该类蛋白质结合形成非共价复合物从而是,RNA,酶失活。,RNA,酶蛋白抑制剂与靶蛋白的亲和力大。,商品化的,RNA,酶蛋白抑制剂的名称各异（如,RNAsin,等）。,3.还原剂,加入,-,疏基乙醇、二硫苏糖醇（,DTT）,等还原剂可以还原,RNase,中的二硫键，有利于,RNase,的变性、水解与灭活。,RNA,提取实验前的准备,【,使用器具,】,尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，则使用,0.1%DEPC,水溶液在,37,处理,12h,，后,120,高压,30min,，去除残留,DEPC,【,试剂配制,】,无菌水须用,0.1%DEPC,处理后高温高压灭菌,RNA,实验试剂应,RNA,提取专用，避免其他试剂交叉污染,【,其他,】,实验过程中使用一次性手套，并经常更换；在,RNA,专用区操作，操作过程中避免交谈, ,三、酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法,首先以含异硫氰酸胍、,-,疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞。,然后在,pH4.0,的条件下，酚/氯仿抽提细胞裂解溶液。,最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总,RNA。,本法具有简便、快速、经济、高效及提取的,RNA,质量高等优点，能在3小时内迅速处理多个标本。,总,RNA,产量取决于标本的起始量，每,mg,组织大约能制备4,7,g,总,RNA，,每10,6,个细胞大约为4,10,g。,四、商品化的单相裂解试剂法分,RNA,本法是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案。,以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。,变性的,DNA,与蛋白质介于两相的交界面，可使用乙醇和异丙醇分级沉淀出来。,保留于上层水相的,RNA，,通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。,四、商品化的单相裂解试剂法分,RNA,目前，该法已成为实验室最常用的总,RNA,提取法，其产量及质量与前法相当。,Trizol,五、,mRNA,的分离纯化,除血红蛋白及组蛋白的,mRNA,外，绝大多数,mRNA,在其,3末端带有长短不同的,poly（A）,尾巴,。,利用碱基配对原则，通过,oligo,（,dT,）-,纤维素或,poly（U）-,琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总,RNA,制品中分离,纯化,mRNA,。,1.,oligo,（,dT,）-,纤维素柱层析法,2.,oligo,（,dT,）-,纤维素柱离心法,3.,oligo,（,dT,）-,纤维素液相结合离心法,4. 磁性球珠分离法,（1）,oligo,(,dT,)-,纤维素层析柱法,（2）,oligo,(,dT,)-,纤维素液相结合离心法,（3）磁珠分离法,实验步骤,1 每,mg,组织中加入1,mlTrizol,试剂，高速破碎组织（使用高速组织捣碎器）,2 加入氯仿0.2,ml,轻轻颠倒混匀，室温静置分层。,3. 高速离心12000,rpm，4-8,C,，10分钟,4.吸上清液至新离心管中，约600,ul,5,加入500,ul,异丙醇，混匀，室温静置10分钟,6.高速离心12000,rpm，4-8,C,，10分钟,7.弃上清液，沉淀为,RNA,8.,加入1,mlDEPC,处理的75%乙醇，混匀，7500,rpm,离心，,4-8,C,，5分钟,9.加入,DEPC,处理水30,ul,，,混匀，55-60,C,水浴,10.3ul,加入297,ulDEPC,水，测定浓度和纯度,RNA,浓度（,g,/ml）=A260,40 1/,光径,稀释倍数,RNA,纯度=,A260/A280,比值为2.0表明,RNA,较纯,RNA,鉴定,浓度鉴定,紫外吸光光度法,:,A,260,稀释倍数,40,g/ml,(OD260-OD320),稀释倍数,40,g/ml,纯度鉴定,OD260/OD280 (1.8,2.0,),Ratio,2.2 : RNA,可能已经水解成单核苷酸,注：测定吸光值，稀释液应使用,正常时，28,S RNA,的荧光强度约为18,S RNA,的2倍，否则提示,RNA,的降解,完整性鉴定：,如何避免含量较低？,.,时可能存在的问题？,核酸的贮存,RNA,保存,RNA,可溶于0.3,mol/L,的醋酸钠溶液或双蒸水，在,-70保存。,RNA,可溶于70%的乙醇溶液或去离子的甲酰胺溶液中，可在-20 保存。,RNA,如果以,DEPC（,焦碳酸二乙酯）可以抑制,RNA,酶对,RNA,的降解,