VIG病毒诱导基因沉默技术

, 2013 American Society of Plant Biologists,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,What are RNA,i,?,RNAi,现象早在,1993,年就有报道,:,将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中,希望得到紫色更深的花,可是事与愿违,非但没有加深紫色,反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能,称这种现象是,“,共抑制,”,。,直到,1998,年, Fire,等的研究证明,在正义,RNA,阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链,RNA,使基因,“,沉默,”,了。研究人员将这一现象称为,RNA,干扰,(RNA,interference,RNAi,),。研究者因此获得了,2006,年诺贝尔生理学或医学奖。,What are RNA,i,?,RNA,干扰广泛存在于生物界，在不同物种中,RNA,干扰被赋予不同的名称,:,在,植物体,中被称为,基因共抑制,（,co-suppression,）,在,真菌,中被称为,基因阻抑,（,qulling,）,在,动物体,内被称为,RNA,干扰,（,RNAi,）,现今用于植物,RNAi,技术按,导入方式的不同,有粒子轰击、病毒诱导基因沉默,(VIGS),、农杆菌介导等方式。,Virus Induced Gene Silencing(,VIGS),病毒诱导的基因沉默,(virus induced gene silencing,VIGS,),是指通过对已知植物病毒的改造，将目标基因片段整合入,病毒载体,中，然后侵染植物,诱发,RNAi,途径,随着病毒的复制和转录而特异性地诱导序列同源基因,mRNA,降解或被甲基化等修饰，从而引起植物表型或生理指标变化，实现对该功能基因的鉴定。,VIGS,原理,dsRNA:,双链,RNA;,Dicer,酶,:,核糖核酸酶, (Ribonuclease, RNase ),家族的成员,;,siRNA:,小干扰,RNA ;,RISC:RNA,诱导沉默复合体,VIGS,应用的载体,利用植物病毒作为载体的优点,:,病毒能吸附到,完整,的植物细胞并将它们的核酸导入到细胞中,感染的植物细胞产生,大量,的病毒，因此重组病毒载体可以高效表达转入的外源基因。,病毒感染可以蔓延,整个植株,病毒感染,快,VIGS,应用的载体,RNA,病毒,(,最早最多,),1995,首次基于,烟草花叶病毒,TMV,载体构建,(,携带八氢番茄红素脱氢酶,PDS,侵染烟草，上位叶片褪绿白化,),1998,马铃薯,X,病毒,PVX(,沉默,PDS,诱发白化效应,),2001,烟草脆裂病毒,TRV(,因其具有病毒,症状较轻、沉默效率高、持续时间长、能够侵染分生组织,应用，目前应用,最广泛,VIGS,载体,),PDS,即,八氢番茄红素脱氢酶,，是类胡卜素合成所必需的酶，具保护叶绿素免受光漂白的作用，而,PDS,基因发生沉默后被侵染植物就会表现出光漂白症状。,PDS,表型变异,易于辨别,，因此,PDS,基因成为,VIGS,体系评价的,参照基因,。,VIGS,应用的载体,DNA,病毒,(,载体构建简便、无需体外转录、操作难度低,),1998,基于双生病毒,番茄金色花叶病毒,TGMV,的,VIGS,体系成功建立,(,第一例,DNA,病毒载体,),2004,非洲木薯花叶病毒,ACMV,2008,棉花皱叶病毒,CLCrV,2010,水稻东,格鲁,杆状病毒,RTBV(,实现,农杆菌介导,接种高效,沉默水稻內源,基因,PDS,，,第,1,例,能够通过农杆菌介导接种水稻的,VIGS,载体,),VIGS,应用寄主,寄主范围有限，针对,不同的寄主植物,往往需要开发,不同的病毒载体。,2002,，大麦,抑制,PDS,（,大麦条纹花叶病毒,BSMV,，进一步在,小麦,上应用）,2006,，水稻、大麦和玉米（雀麦花叶病毒,BMV,2006,，大豆（多组分病毒菜豆荚斑驳病毒,BPMV,）,2010,，大豆（改造后无需体外转录，增加沉默效率）,VIGS,的应用,抗旱研究,中相关基因的功能分析,2011,，沉默小麦上,S-,腺苷甲硫氨酸合成酶基因,(SAMS),、,S-,腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因,(SAMDC),、,-,谷氨酰半胱氨酸合成更美基因,(-ECS),三个基因。,沉默植株经干旱胁迫后较正常植株在形态上有明显的变化，其叶片的卷曲萎蔫程度较为突出，说明这三个基因在小麦抗干旱胁迫中具有重要功能。,VIGS,的应用,品质改良,相关基因的功能分析,2012,，,利用,VIGS,技术发现高分子量谷蛋白亚基,HMV-GS,1Bx14,和小麦籽粒中麦谷蛋白聚合体合成有关。,这也是首次报道,VIGS,技术应用于,小麦穗子和籽粒,相关的基因功能，同时这个体系的建立将会对研究与籽粒品质和在小麦渐成的籽粒中有关基因的功能起到很大帮助作用。,VIGS,优点,在未获取全长序列甚至,事先不知道序列,的情况下即可进行,VIGS,分析。,操作简便，能快速获取表型。,无需构建转基因植株。这对于那些转基因植株获取非常困难的植物种类来说至关重要,可用于突变致死的基因功能研究。,可用于功能冗余基因的功能研究。,可用于快速的不同植物种类间比较基因组学的研究。,VIGS,缺陷,VIGS,引起目标基因的沉默特征,不具有遗传性,，以致,VIGS,技术并不能彻底揭示基因的功能，这是此种技术自身最大的局限性。,如何获得目标基因的系统性沉默仍然是,VIGS,技术目前需要解决的问题。,沉默,持续的时间,问题。,病毒载体如何有效地接种入植物体内，并产生较强的沉默效果，是,VIGS,技术实验操作中的关键性步骤。,病毒诱导的基因沉默,(VIGS),的获得,1.,设计引物,(,保守序列，,200bp),2.,构建载体,(),3.,体外转录,(,准备质粒，线性化质粒,),4.,体外涂抹,5.,观察病毒表型,(BSMV),（提取,RNA,反转录成,cDNA,检测基因表达水平）,6.,观察表型,