第五章SEM样品制备技术

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第六章,SEM,生物样品的制备与观察,一、,扫描电镜样品观察特点,(,一,),能够直接观察样品表面的结构,;,(,二,),景深大，图象富有立体感。扫描电镜的景深较光学显微镜大几百倍，比透射电镜大几十倍,;,(,三,),样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转，因此，可以从各种角度对样品进行观察,;,(,四,),在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。,二、扫描电镜样品的制备,（一）要求,1.,尽可能保持生物活体时的近似形态结构。,2.,有较高的耐电子轰击能力,有较好的导电性能和较高的二次电子发射率。,二、,、扫描电镜样品的制备,（二）样品的类型及处理程序,1.,硬组织,如毛发、骨、牙齿、贝壳、花粉、孢子、种子、木材和其它质地较硬含水量较少的样品等,。,样品处理程序：,取样 清洁 装台 导电处理 电镜观察。,（二）样品的类型及处理程序,2.,生物软组织,大部分动植物质地较软含水量较多的组织器官均属此类。,样品处理程序：,取样 清洗 固定（单、双） 漂洗 脱水 干燥 装台 导电处理 电镜观察。,（二）样品的类型及处理程序,3.,金属材料等,取样 清洁电镜观察。,(,如金属材料等,),4.,断面,取样 清洁冷冻断裂干燥粘 样镀膜电镜观察。,（三）干燥的方法,1.,自然干燥法,是将浸泡在有机溶剂中的样品，放在大气中自然蒸发而干燥。,优点：,简单易做，省时间。,缺点：,收缩变形严重。,（三）干燥的方法,2.,临界点干燥法,（,1,）临界点,指使一种物质处于液态和气态间均一流体状态时的压力和温度的总称。,在临界点状态时其表面张力消失。,（三）干燥的方法,（,3,）临界点干燥的原理,临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全气化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。,（三）干燥的方法,（,4,） 临界点干燥仪外型结构图,（三）干燥的方法,（,5,）临界点干燥流程,固定 脱水 乙酸异戊酯 放样品入杯中,(,预冷比室温低于,10,0,C,以下,),注入液态,CO,2,在,20,0,C,停留,10min,排放,CO,2,（,回到预冷温度）,注入液态,CO,2,在,20,0,C,停留,10min ,加温至,35,0,C,到达临界点后，以,0.1L/min,排放,CO,2,镀金 观察。,（三）干燥的方法,（,6,）几种液体的临界特性,几种物质的临界点温度和压,物质,二氧化碳,佛利昂,-13,一氧化二氮,水,乙醇,丙酮,温度,31.5,28.9,36.5,374.0,243.0,235.0,压力,71.34,37.34,69.78,218.0,63.0,47.0,中间液,乙酸异戊酯,乙醇,（三）干燥的方法,（,7,）临界点干燥样品优点：,a,、,临界点干燥后生物样品少变形或不变形。,b,、,临界点干燥仪操作简单方便。,C,、,相对于冰冻干燥时间短。,缺点：,a,、,要使用专用临界点干燥仪。,b,、,干燥真菌孢子等易脱落。,（三）干燥的方法,（,8,）临界点干燥注意事项：,a.,样品装入干燥篮时防止表面干燥。,b.,临界点干燥样品杯要先预冷至,10,0,C,以下。,c.,一次干燥样品不宜太多。,d.,冲,入,CO,2,流量速度要慢,(,以免压力改变太快有损样品,),。,e,、,操作要轻,(,特别是装样入篮时,),。,（三）干燥的方法,3.,冰冻干燥法：,生物样品在超低温,(-150,0,C-180,0,C),的情况下快速冷冻样品，然后在真空中升华，从而使样品达到干燥。,（三）干燥的方法,冰冻干燥原理：,由于快速冷冻成固态，在真空中直接由固态变成气态而升华干燥，所以免除了液态的表面张力影响。,（四） 样品的导电处理,生物样品干燥后其导电性都较差，用扫描电镜观察过程中电子束打在样表面时会产生电荷积累或称放电现象。,因为电荷积累会严重干扰样品本身的二次电子信号，产生澡音严重影响图像质量，因此必须进行导电处理。,（四）样品的导电处理,1.,导电处理的目的,（,1,） 使样品表面导电；,（,2,）提高二次电子发射率；,（,3,）增强样品表面耐受电子轰击能力；,（,4,）防止来自样品内部的信号干扰；,（四）样品的导电处理,2.,增强导电的方法,（,1,）金属镀膜法,a.,真空镀膜,(,蒸发,),是在高真空下将金属材料加热熔化后，复盖在样品表面形成导电层的一种方法。,真空蒸发仪图形,（四）样品的导电处理,使用仪器为真空蒸发仪，放入纯金和碳棒,;,蒸发点与样品距离在,710cm;,加热时间,12 min;,电流,1520Am;,真空度在,110,-4,乇以上进行旋转镀膜。,（四）样品的导电处理,2.,离子镀膜,(,溅射,),在低真空状态下利用离子溅射仪对扫描电镜样品进行覆膜的方法。,（四）样品的导电处理,原理,：,在离子溅射仪的结构上有一个阴极金靶，下有一个阳极样品座。,在阴极金靶上加高压、电流与阳极形成电场，从而使气体电离加速飞向阴极金靶，并击发出带负电位的金粒子而飞向阳极样品的表面上，形成粒子很细厚度均匀的导电层。,离子溅射仪镀膜示意图,（四）样品的导电处理,离子镀膜,(,溅射,),优点：,(1),粒子细；,(2),镀膜均匀；,(3),用金量少；,(4),镀膜时间短。,缺点：,由于样品处于电场中会有些损伤,(,样品不,能太近,),。,（四）样品的导电处理,注意事项：,(1),样品应充分干燥，镀膜时会产生紫蓝色弧光。,(2),不同的金属靶会有它不同的溅射条件。,(3),镀膜时如真空度大幅度下降应立即停止溅射。,（四）样品的导电处理,3.,导电液常用处理,(1),碘化钾组织导电液：,碘化钾,2g,碘,0.2g,双蒸馏水,100 ml,2.5%,戊二醛,10 ml,。,(2),硝酸银组织导电液：用,0.1m,磷酸缓冲液配的,1.5,3%,硝酸银溶液,(,暗环境保存,),。,(3),丹宁酸组织导电液：用,2%,4%,丹宁酸加,8%,戊二醛。,常规的扫描电镜样品制备方法,固定 脱水 干燥镀金 观察。,