第四课 离心吸附柱法纯化PCR产物

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第四课,离心吸附柱法纯化PCR产物,1,实验原理,离心吸附柱纯化DNA的原理就是在离心吸附柱内使用一种特殊的硅基质滤膜，这种滤膜在低PH值、高浓度盐（盐酸胍，NaI, NaClO4等）存在的条件下，可以选择性吸附DNA片段，而蛋白质和其它杂质不会被吸附。再通过一系列漂洗、离心等步骤将残留的引物、核苷酸、蛋白质等杂质去除。最后用低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净的DNA从滤膜上洗脱下来。,利用硅基质膜的过滤吸附操作，大大简化了核酸纯化过程，提供了一种快速、高通量的纯化方式。除单管离心柱外，已经有96孔板、384孔板等核酸纯化产品。,目前，硅基质膜吸附法已经成为目前核酸分离纯化最主流的技术。通过该技术纯化的DNA片段可直接用于的酶切、连接、测序、标记和杂交等各种常规分子生物学操作。,2,试剂盒组成及储存方法,名称,保存条件,溶胶/结合液 DB,RT,漂洗液 WB,RT,洗脱液 EB,RT,3M 醋酸纳（pH 5.2）,RT,异丙醇,RT,吸附柱 AC,RT,收集管 （2ml）,RT,3,实验步骤,每,100lPCR,扩增产物加入,500l,溶胶,/,结合液,DB,，充分混匀。（如果初始体积小于,100l,，用纯净水调整至,100l,）,。,注：本实验每位同学起始样品为,25,lPCR,产物。,将吸附柱,AC,放入收集管中，再将溶液转移至吸附柱内，室温放置一分钟，,12000 rpm,离心,1,分钟，弃去收集管内废液，再将离心柱放回收集管中。,加入漂洗液,WB 700l,（确认已加入无水乙醇！），,12000 rpm,离心,1,分钟，弃去收集管内废液，将吸附柱放回收集管。,加入漂洗液,WB 500l,，,12000 rpm,离心,1,分钟，弃去收集管内废液，将吸附柱放回收集管。,12000 rpm,离心,2,分钟,以尽量除去漂洗液，以免漂洗液中的残留乙醇抑制下游反应。,取出吸附柱，放入一个干净的离心管中。在吸附膜中心位置加入,50l,洗脱液,EB,，不要触及滤膜。室温放置,2,分钟。,注：本实验用,30lEB,洗脱。,12000 rpm,离心,1,分钟。,如欲使洗脱更为充分，可将得到的洗脱液重新加入吸附柱，,12000 rpm,离心,1,分钟。,-20,保存。,4,实验步骤DNA琼脂糖凝胶电泳,用,1XTAE,配制,1%,的琼脂糖凝胶（,40ml,）。,置微波炉中加热至沸腾,琼脂糖完全溶解。,100,凝胶中加入,5ulDNA,染料（,GoldView,）。,待稍冷却后制备,DNA,检测用凝胶。（本实验凝胶槽加,35ml,凝胶）。,待凝胶完全凝固后，将凝胶放入电泳槽中。在电泳槽中加入,1XTAE,至液面恰好漫过凝胶表面。,吸取,1,l,纯化的,DNA,4,l,H,2,O,与,1,l 6X,电泳样品缓冲液混匀。,将样品加入电泳凝胶的样品孔中。,在实验组样品旁的样品孔中加入,6,l 100bpDNA,分子量标准品。,在加样孔侧接负电极，相反方向接正电极，以,8V/cm,的恒定电压电泳适当时间。,电泳结束后，将凝胶取出，置紫外灯箱上观察质粒,DNA,的电泳情况。,5,注意事项,第一次使用前先在漂洗液WB中加入指定量的无水乙醇，加入后及时做好标记，以免多次加入。,在低温时溶液可能形成沉淀，使用前在37加热使溶液澄清。待溶液恢复到室温后使用。,各种溶液使用后应及时盖紧，以避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化。,所有操作在室温完成。若溶液沾染皮肤、眼睛时，立即用大量清水冲洗。,如纯化的DNA片段大小在100bp到50kb之间，起始量在5g-25g之间则回收率可达85%-95%。否则回收效率将大大降低。,如DNA和结合液混合后PH值7.5，溶液保持黄色，吸附膜吸附DNA的效率最高。如果溶液变成橘红色或淡紫色，则说明PH偏高，可在溶液中加5-10l的3M醋酸钠（PH5.2）将PH值调到5-7之间（溶液呈黄色）。,适当减小洗脱体积可提高回收DNA的浓度。但体积小于30l将降低洗脱效率。,洗脱液EB不含EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以用PH大于7.5的水洗脱。PH过低影响洗脱效率。,6,