应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,应用纸层析法鉴定酶促转氨基作用,生物化学与分子生物学实验教学中心,1,实验原理,实验试剂,实验步骤,2,实验原理,氨基酸分子上的氨基转移到,-,酮酸分子上的反应称为转氨基作用,.,转氨基作用是氨基酸的重要反应之一，由转氨酶催化,.,经转氨基后,原,来的氨基酸变成了酮酸，原来的酮酸变成相应的氨基酸。,纸层析是以滤纸作支持物，用一定的溶剂系统展开，使混合样品,达到分离分析的层析方法。其一般操作是将样品溶解在适当溶剂中，,点样在滤纸的一端；再选用适当的溶剂系统，从点样的一端通过毛细,现象向另一端展开，展开完毕，取出滤纸晾干或烘干，再以适当的显,色剂或紫外灯、荧光灯下观察其图谱。样品经展开后其一物质在纸层,析谱上的位置常用比移值,Rf,来表示。,Rf =,3,纸层析可看作是溶质（样品）在固定相与流动相之间的连续抽,提，由于溶质在两相之间的分配系数不同而达到分离。一定的物质在,两相间有固定的分配系数，因而在恒定条件（液剂、,PH,、温度）,下，各物质有固定的,Rf,值，据此可达到分析鉴定的目的。,由于滤纸纤维可吸收,20,25%,的水分；且其中,6,7%,以氢键形式,与纤维素上羟基结合，一般条件下难脱去；所以纸层析实际上是以水,相作固定相，展开的溶剂作流动相。,纸层析操作按溶剂展开方向可分为上行、下行和径向三种。氨基,酸分离一般用上行法。上行法又分单向（成分较为简单的样品）和双,向（单向时斑点重叠分离不开，于是在其垂直方向用另一种溶剂系统展层）。双相层析谱可分辨十几种以上的样品。,4,实验试剂,1,0.01M pH7.4,磷酸缓冲液：,0.2 M Na2HPO4,溶液,81ml,与,0.2M,NaH,2,PO,4,溶液,19ml,混匀，加蒸馏水稀释,20,倍。,2,0.1M L-,丙氨酸：称取,0.891g L-,丙氨酸（如,DL,丙氨酸用量加倍），用,少量,0.01 M pH7.4,磷酸缓冲液溶解，以,NaOH,溶液,小心调,pH,至,7.4,，再用磷酸缓冲液定容到,100ml,。,3,0.1M L-,谷氨酸：称取,1.47 g,谷氨酸如上法配成,100 ml,溶液。,4,0.1M L-,酮戊二酸：称取,1.46 g-,酮戊二酸如上法配成,100 ml,溶,液。,5,层析溶剂 ：用水饱和的苯酚。用新蒸馏的苯酚,2,份，加蒸馏水,1,份,(V/V),，放入分液漏斗中剧烈摇动后，在暗处静置若干时,间（,7-10,小时），待分层后，取下层清液备用。贮于棕色,瓶中暗处保存。,6,0.1%,（,W/V,）茚三酮,5,实验步骤,1,肉糜制备：称取新鲜猪肝,5,克在低温下剪碎，用研钵研磨,成糊状备用。,2,酶促反应 按表次序在,2,支试管中加入试剂。,管号,试剂,对照管,测定管,0.1mol/L,丙氨酸,(ml),0.1mol/L-,酮戊二酸,(ml),0.01mol/LpH7.4,磷酸缓冲液,(ml),肉糜（,g,）,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,1.0,6,对照管当肉糜加入后立即煮沸,l0min,，而后放人,37,水浴中与测定管同时保温，测定管加入肌肉糜后放人,37,水浴中保温,lh,，然后于沸水浴中加热,10min,终止反应。冷,却后将二管分别静置以备层析用。,3,层析： 取直径,10-llcm,圆形层析滤纸（已打孔）一张，,通过圆心作一直径为,2cm,的圆，在圆周上分别取,4,等距点,分别作测定管和对照管溶液及标准丙氨酸、谷氨酸的点,样位置，点样时，将蘸水笔（使用前应放在酒精灯上烧,红，冷却，对应溶液只能用对应的笔点样）轻轻靠到滤,纸上,(,不能损伤滤纸,),，使斑点直径为,2-3 mm (,不能超过,5mm),。为了有足够量的样品点在滤纸上，每种样品应,重复点,3-4,次，每次点样后待自然风干，再点下一次。,7,另取一滤纸小条将其下端剪成刷状，卷成“灯芯”插人中心,小孔处，使“灯芯”不突出纸面,(,少许突出纸面亦可,),。然后将,该层析圆滤纸平放在盛有水饱和酚的康维皿上，纸芯下端,须状部分浸人溶液中，再在层析滤纸上罩一个大小合适的,表面皿，溶剂沿纸芯上升到滤纸，再向四周扩散，待溶剂,前沿到达距康维皿边缘,0.5-lcm,处时,(,约,lh,左右,),，取出层析,滤纸，去掉纸芯，记下溶剂前沿，在电炉子上烘干以除去,酚溶剂。,将已烘干的滤纸平放于表面皿上，用喷雾器向滤纸均,匀喷洒,0.1%,茚三酮溶液，放在电炉子上烘干即可看到好几,个紫红色斑点，比较各色斑点的位置及色泽深浅，并计算,Rf,值，分析实验结果。,8,