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*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四讲细胞生物学研究方法,细胞生物教研室,李想,第三节 细胞组分的分级分离,（一）破坏细胞的方法：,低渗透压、超声震荡、机械破碎等,细胞悬浮液,匀浆液,微粒体：内质网形成的小泡,膜,细胞器,大分子,（二）细胞组分的分级离心,差速离心,速度沉降,平衡沉降,1,差速离心,分离细胞核与细胞器,根据组分的大小和形状分离不同大小的细胞和细胞器。,在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心,在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体,。,差速离心的原理,2,、,速度沉降,用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。,样品置于含有蔗糖的稀盐液上层,，,生物颗粒（细胞或细胞器）在十分平缓的密度梯度介质（,5%,20%,蔗糖）中按各自的沉降系数（大小与形状）以不同的速度沉降而达到分离。,(2),等密度,(,平衡,),沉降,取决于细胞成分的浮力密度，与大小形状无关,制备较高浓度差的介质（,20%,70%,蔗糖或氯化铯），将待分离样品均匀分布在介质中，,高速或超速离心，离心时间也较长。,非细胞体系：,从分级分离得到的具有生物功能的细胞抽提物，用于研究其生物学功能。,柱层析：,使蛋白质混合液通过含有多孔固体基质的柱中，不同蛋白质与基质相互作用被不同程度 的滞留，这样可在柱底将它们分别收集。,（三）、分离蛋白质,柱层析,据填充颗粒不同分为：,（,1,）离子交换层析 ： 电荷,（,2,）凝胶过滤层析： 大小,（,3,）亲和性层析： 与蛋白质表面特异结合,（,4,）疏水性层析： 疏水性基团,（四）、检测蛋白质,电泳,1. SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,SDS-PAGE,）,按蛋白质分子量大小分离，适用分析任何种类的蛋白质，能确定蛋白分子量和亚基组成，但是，电泳是在变性条件下分离，功能多已丧失。,(2),蛋白印迹,利用特异抗体来鉴定相应的蛋白质,1.,原理,待分析的蛋白质样品经,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，再转移至硝酸纤维素滤膜上，并与所研究的蛋白质特异抗体发生免疫反应。是在蛋白质水平定量检测基因表达改变的主要方法。,2.,等电聚焦电泳,按照蛋白质等电点的不同分离蛋白质。,原理：,在丙烯酰胺凝胶两端形成电场，含有不同等电点的两性电解质在电场当中形成,PH,梯度，样品中所有的蛋白质在电泳时都向自己的等电点处移动、聚集。分离效果好,步骤：,1,、等电聚焦电泳,3.,双向电泳,按照蛋白质的等电点和大小进行分离,等电聚焦与,SDS-PAGE,结合分离效果好,第四节 细胞化学和细胞内分子示踪技术,细胞化学技术：是在保持组织原有结构的情况下，利用生物分子的物理和化学性质来研究他们在细胞内的分布、数量及动态变化。,包括：酶细胞化学技术,免疫细胞化学技术,放射性自显影技术,绿色荧光蛋白技术,放射自显影技术,.,原理,：将放射性同位素（如,14,C,和,3,H,）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。,一般常用,3H,胸腺嘧啶脱氧核苷（,3H-TDR,）来显示,DNA,，用,3H,尿嘧啶核苷（,3H-UDR,）显示,RNA,；用,3H-,亮基酸和,35S-,蛋氨酸标记蛋白质，研究多糖则用,3H,甘露糖、,3H,岩藻糖等。,2.,绿色荧光蛋白,（,green fluorescent,protein,GFP,）,最早是在海洋生物水母中发现的。,GFP,蛋白的多肽链中含有特殊的生色团结构，可在紫外光源下发出稳定的绿色荧光。并这种荧光发射无需外加辅助因子或进行任何特殊处理。,GFP,标记分子最常作为标记物来追踪结合分子的表达水平和定位，或作为检测环境变化或蛋白相互作用的指标。目前广泛用于分子和细胞生物学各个领域。,构建与绿色荧光蛋白融合的蛋白,Map of pEGFP-C1 vector,a,b,马丁,沙尔菲,(,左,),、下村修,(,中,),和钱永健,在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而分享,2008,年诺贝尔化学奖,第五节 分子生物学实验技术,一、核酸,DNA,技术,（一）、分离,DNA,电泳技术,1,琼脂糖凝胶电泳,样品不需处理可直接电泳；分辨力低；,不适合分离,100,碱基以下的核酸分子,2,丙烯酰胺凝胶电泳,分辨力高，分离,500,碱基以下的,DNA,分子；操作复杂；所需时间长,（二）、,PCR,技术,1.,聚合酶链式反应,(,PCR),：,用于在体外将微量的目标,DNA,大量扩增，以便进行分析。,(1),反应体系：,样品,DNA,；,引物,是人工合成的一对寡核苷酸链（约,15-20,个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板,DNA,互补区之间的区域；,4,种,dNTP,；,Tag,DNA,聚合酶,，是从一种嗜热水生菌）中分离出来的。此酶最适作用温度,7580,，但短时间在,95,下不失活,。,适宜的缓冲体系和适量的,Mg,2+,。,(2),反应过程,：,变性,：（约,90- 95,）使,DNA,双链解离,复性,：降温（约,60,左右）退火，使引物与模板结合,延伸,：升温度至,70-75,，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成,DNA,双链片段,重复上述,“,变性,复性,延伸,”,的过程,。,最初几次 循环中形成的长链,DNA,较多，但随着反应的进行，长链,DNA,以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目标,DNA,以指数级数增长，经大约,20,30,次循环后，扩增产物中主要是目标,DNA,。,二、核酸分子杂交技术,分子杂交技术,在研究,DNA,分子复性变化基础上发展起来的一种技术。,1.,原理：,具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成,DNA-DNA,，,DNA-RNA,或,RNA-RNA,杂交的双链分子。,2.,探针：,将一条已知序列的单链核酸片段用放射性核素或其它标记物标记,3.DNA,变性,:,当溶液中的,DNA,分子处于高温或高,pH,值,(13),条件下,维持双螺旋在一起的碱基互补对就被破坏,DNA,双链解离成两条单链,这一过程叫,DNA,变性。,4.DNA,复性,:,当温度降低至合适温度或恢复,pH,值至中性，两条裂解的单链按碱基互补配对原则重新形成双链结构,这一过程叫,DNA,复性,又叫,DNA,杂交。,（一）、原位杂交,用核苷酸探针在细菌、细胞、或组织切片上对特殊的核苷酸顺序在其原位进行杂交,叫原位杂交。对被杂交的,DNA,或,RNA,分子进行定位和定量研究。,人类染色体端粒,DNA,的荧光原位杂交照片,（二）、,Northern blot,将从组织细胞中提取的,RNA,混合物用琼脂糖凝胶电泳按大小分离，分离后的核酸条带原样转移到硝酸纤维膜或尼龙膜上，再用特异的,DNA,探针检测互补的,RNA,分子，这一过程称为,RNA-DNA,用于基因表达的特异性分析和定量分析,（三）、,Southern blot,DNA-DNA,用于,DNA,重组子的鉴定；基因突变分析；基因敲除与转基因动物的鉴定,转化,transformation,：,载体导入原核细胞表达,转染,transfection,：,载体导入真核细胞表达,三、外源基因表达技术,四、生物芯片技术,DNA,芯片,-,基因芯片、,DNA,阵列、,cDNA,芯片或寡核苷酸阵列,原理,：,是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量预先合成的,DNA,探针以显微打印的方式有序地固化于支持物的表面，再与经过荧光标记的样品进行分子杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的相关信息。,蛋白质芯片,：是将大量蛋白质或多肽微固化支持物表面，通过蛋白质,-,蛋白质相互作用（包括抗原抗体反应，受体配体识别等），对样品中靶蛋白分子进行高通量检测的一种技术。,原理,：把荧光标记的待检样品与芯片上的蛋白质探针结合，洗脱未反应成分后检测特异的反应信号。,五、鉴定蛋白质,质谱技术,质谱：,在真空状态下，用电子轰击气态样品使其离子化，或用高速粒子轰击液相、固相成分，使样品向气态中逸脱并离子化，这些离子根据质量数,/,电荷数（,m/z,）的顺序在电场的作用下分离并被记录,用途,是测定小分子分子量最准确的方法,用于检测翻译后的氨基酸修饰,进行蛋白质测序,总结：,几种光学显微镜的成像原理与应用,电子显微镜的分类与成像原理,光镜与电镜的分辨率，标本制备方法,细胞培养、原代培养、传代培养、细胞系、细胞株、细胞克隆、细胞融合的概念,细胞组分离心的原理,柱层析分离蛋白的方法，原理,蛋白质电泳的方法，原理,DNA,电泳的分类,PCR,技术的概念，步骤，反应体系,核酸分子杂交的分类，原理,
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