5.1DNA的粗提取与鉴定(使用)

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,专题5 DNA和蛋白质技术,课题1 DNA的粗提取与鉴定,课题目标,目标:,1,本课题通过尝试对植物或动物组织中的DNA进行粗提取，了解DNA的物理化学性质，,2理解DNA粗提取以及DNA鉴定的原理。,课题重点：,DNA的粗提取和鉴定方法。,知识要点：,1. DNA的物理化学性质，尤其是DNA的溶解性,2. 二苯胺法鉴定DNA的方法和原理,。,基础知识,1、,提取大分子的基本思路是什么？,选用一定的,物理,、,化学,方法分离,具有不同物理或化学性质的大分子,。,2、,提取DNA分子的基本思路又是什么？,利用DNA与,RNA、蛋白质和脂质,等在物理和化学性质上的差异，提取DNA，去除其他成分。,3、,提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？(原理),1）、DNA的溶解性,DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的,NaCl,溶液中溶解度不同。,1、在什么浓度下，DNA的溶解度最小？DNA在Nacl 溶液中的溶解度是如何变化的？,在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时，DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低；在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。,2、如何通过控制NaCl溶液的浓度使DNA在盐溶液中溶解或析出？,当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,3、,提取和鉴定DNA的具体的依据有哪些方面？,1）DNA的溶解性,DNA和蛋白质等其它成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同。,DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精,2）、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性,蛋白酶只能使蛋白质水解,大多数蛋白质不能忍受6080,的高温而变性，但DNA在80 ,以上才变性。,洗涤剂能瓦解细胞膜，,但对DNA没有影响。,3、DNA的鉴定,沸水浴,下，DNA遇,二苯胺,被染成,蓝色,；,二苯胺鉴定DNA的化学原理：,DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成-羟基-酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色,(溶液呈浅蓝色)。,鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。,紫外灯照射法：,紫外灯照射法用蒸馏水配制质量分数为0.05%的,溴化乙锭(EB),溶液，,将玻璃棒上缠绕的白色絮状物抹到蜡纸上，再滴1滴EB溶液染色。将蜡纸放在紫外灯(260 nm)下照射(暗室中)，可呈现,橙红色的萤光,(DNA的紫外吸收高峰在260 nm处)。,甲基绿 （蓝绿色）,实验设计,（一）实验材料的选取,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,（三）去除滤液中的杂质,（四）DNA的析出与鉴定,实验设计,（一）实验材料的选取,含有DNA的组织且DNA含量较多的组织。,比较下列材料哪些DNA含量高、适于提取,DNA？为什么？,哺乳动物红细胞：,大肠杆菌：,鸡血细胞：,没有细胞核，没有DNA。,原核生物，DNA含量少。,DNA含量丰富，材料易得，易吸水胀破。,DNA含量相对较高的生物组织。,。,较好的实验材料应该满足以下几个条件,：,1组织中DNA的含量比较丰富,能够适合大量提取。,2该组织中所含化合物种类应比较单纯,避免由于其他,物质化学性质与DNA相近，从而对实验现象产生某,些干扰。,3实验材料的价格适宜，从而能相对的降低实验成本。,4实验材料在实验过程中的可操作性较强，在相对简单,的条件下能大量提取出DNA，便于学生实验操作,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞：蒸馏水 搅拌,1、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？,蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA。,旁栏问题,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,1、动物细胞：蒸馏水 搅拌,2、植物细胞：洗涤剂和食盐 搅拌和研磨,若探究提取效果，可设置对照实验,。,2、加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,洗涤剂是一些离子去污剂，,能溶解细胞膜，,有利于DNA的释放；食盐的主要成分是,NaCl，有利于DNA的溶解。,旁栏问题,3如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。,旁栏问题,4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。,（三）去除滤液中的杂质,方案一：,DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同,；,实验设计,旁栏问题,5为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,（三）去除滤液中的杂质,方案一：,DNA在不同浓度NaCl中溶解度不同,；,方案二：,加入嫩肉粉（含木瓜蛋白酶）,方案三：,6075恒温水浴保温1015min,实验设计,旁栏问题,6方案二与方案三的原理有什么不同？,方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；,方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。,（四）DNA的析出与鉴定：,95%的冷酒精,静置23min，出现白色丝状物,玻璃棒卷起,加入2mol/L氯化钠溶解，,加入,4mL二苯胺试剂，摇匀，,沸水浴,5min，观察颜色变化。,（注意设置空白对照）,实验设计,使用,冷的乙醇溶液具哪些优点？,一、抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；,二、降低分子运动，易于形成沉淀析出；,三、低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。,P56操作提示,1、血液应加入柠檬酸钠（抗凝剂）防止血液凝固；,2、加洗涤剂，动作要轻缓，防止产生大量气泡；,加酒精、玻棒搅拌，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂。,3、二苯胺试剂现配现用。,结果分析与评价,（一）是否提取出了DNA,观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。,结果分析与评价,（,二）分析DNA中的杂质,本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖等杂质。,（三）不同实验方法的比较,对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。,练习,提取DNA的第一步是材料的选取,，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；,第二步是DNA的释放和溶解,，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；,第三步是DNA的纯化，,即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；,最后一步是对DNA进行鉴定,，这是对整个实验的结果的检测。,1、请解释提取DNA的实验操作中主要,步骤的目的。,练习,提取蛋白质比提取DNA的难度大,。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。,2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与,提取DNA一样容易吗？为什么？,案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,1、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,2、实验原理, DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。, DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。, DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,4、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为01g/ml的,柠檬酸纳溶液（抗凝剂）,100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，精置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。,用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）,过程,柠檬酸钠作用,防止血液凝固,作用机理,柠檬酸钠能与血浆中的Ca,2+,发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca,2+,大大减少，血液就不会凝固,鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,注意事项,讨论：提取鸡血中的,DNA时，为什么,除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆,5、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用,玻璃棒,充分搅拌5 min，,使血细胞加速破裂。,然后，用放有,纱布的漏斗,将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？,得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的,DNA,溶解细胞核内的DNA,将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol的溶40mL加入到滤液中，并用,玻璃棒沿一个方向搅拌,1min，使其混合均匀，这时,DNA在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用,玻璃棒不停地轻轻搅拌，,这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）,析出含DNA的粘稠物,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出,将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。,实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕,注意事项：,滤取含DNA的粘稠物,用放有,多层纱布,的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的,粘稠物被留在纱布上,将DNA的粘稠物再溶解,取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，,用玻璃择不停地搅拌，,使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100 mL烧杯，用放有,两层纱布,的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入,冷却的、酒精的体积分数为 95,的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用,玻璃棒搅拌，,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，,用玻璃棒搅拌，,使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化,DNA的鉴定,讨论：,答：有丝状物的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,（3） DNA的直径约为2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？,答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,答：整个实验共“两次蒸馏水，三次过滤，两次析出，六次搅拌”,6、讨论：,两次蒸馏水,第一次：,细胞吸水胀破,第一步,第二次：使 DNA黏稠物析出 第三步,（1）此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出，几次搅拌？分别在哪一步？,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层,三次过滤,第一次： DNA存在于滤液里 第一步,第二次： DNA被留在纱布上 第四步第三次： DNA存在于滤液里 第六步,两次析出,第一次：用0.14 molL 的NaCI溶液含杂质多,第三步,第二次：用冷却的95的酒精,第七步,六次搅拌：第一、二、三、五、七步,其中除第八步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA,（2）为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,方法步骤,加入物质,目的,1,.,制备鸡血细胞液,柠檬酸钠溶液,2,.,提取鸡血细胞细胞核物质,20 m1,蒸馏水,3,.,溶解细胞核内的,DNA,2 m1,L,的,NaCI,溶液,40,mL,4,.,析出含,DNA,的黏稠物,蒸馏水,5,.,滤取含,DNA,的黏稠物,6,.,将,DNA,的黏稠物再溶解,2 mol,L,的,NaCl,溶液,20 mL,7,.,过滤含,DNA,的,NaC,l,溶液,8,.,提取含有杂质较少的,DNA,冷却的,95,的酒精,50 mL,A,:,(1),向试管中加入,0,.,015 mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2),加入,DNA,(3)4 mL,二苯胺试剂,9,.,DNA,的鉴定,B,:,(1),向试管中加入,0,.,015mol,L,的,NaCl,溶液,5,mL,(2)4 m,L,二苯胺试剂,以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,案例二 以菜花为实验材料进行DNA的粗提取,课前准备 将新鲜菜花和体积分数为95的乙醇溶液放入冰箱冷冻室24 h。,提取DNA的具体步骤,1.取材 称取30 g菜花，去梗取花，切碎。,2.研磨 将碎菜花放入研钵中，倒入10 mL研磨液，充分研磨10 min。,研磨液的配制方法如下。将10.1 g,Tris,加入到50 mL蒸馏水中，使其溶解，然后，用2 moL/L的HCl溶液调节pH至8.0，再加入8.76 g NaCl 、37.2 g,EDTA,、20 g,SDS,。待上述药品全部溶解后，再用蒸馏水定容至1 000 mL。,教材中建议采用洗发香波、洗涤剂等一些去污剂，使植物细胞膜破碎，释放DNA。学生可以设置对照实验，比较哪一种方法可以提取到纯度更高的DNA。一般实验室提取高纯度的DNA都采用一种阳离子去污剂十六烷三甲基溴化铵分离缓冲液，使细胞膜破碎，同时将DNA与植物中多糖等杂质分开，再用氯仿异丙醇混合液（体积比为241）抽提去除杂质蛋白，得到高纯度的DNA。,3.过滤 在漏斗中垫上尼龙纱布，将菜花研磨液过滤到烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心，用1000 r/min的转速，离心25 min，取上清液放入烧杯中)。在4 冰箱中放置几分钟后，再取上清液。,4.沉淀 将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95的预冷乙醇溶液中，并用玻璃棒缓缓、轻轻地搅拌溶液(玻璃棒不要直插到烧杯底部)。沉淀35 min后，可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转，将絮状物缠绕在玻璃棒上。,参考资料,研磨液中几种药品的作用,Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）。,EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。,SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离。,