DNA的提取方法简介课件

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,DNA,的提取方法简介,为了研究,DNA,分子在生命代谢中的作用，常常需要从不同的生物材料中提取,DNA.,由于,DNA,分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适当的材料提取,DNA。,动植物中，小牛胸腺动物肝脏鱼类精子，植物种子的胚中都含有丰富的,DNA。,微生物中，谷氨酸菌体含7%10%，面包酵母含4%，啤酒酵母含6%，大肠肝菌含9%10%。,从各种材料中提取,DNA,方法不同，分离提取的难易程度也不同。,对于低等生物。如从病毒中提取,DNA,比较容易，多数病毒,DNA,分子量较小，提取时易保持其结构完整性。,从细菌及高等动植物中提取,DNA,难度大一些。细菌,DNA,分子量较大，一般达210 道尔顿。因此易被机械张力剪断。细菌,DNA，,除核,DNA,外，还有质粒,DNA,等。,1、核酸的理化性质,RNA,和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，,DNA,则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。,DNA、RNA,和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，,RNA,钠盐在水中溶解度可达40,g/L。DNA,在水中为10,g/L,，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，,DNA、RNA,易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。,天然状态的,DNA,是以脱氧核糖核蛋白(,DNP),形式存在于细胞核中。要从细胞中提取,DNA,时，先把,DNP,抽提出来，再把,P,除去，再除去细胞中的糖，,RNA,及无机离子等，从中分离,DNA 。,DNP,和,RNP,在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而不同。,DNP,在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在0.14,mol/L,的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度的1%,，,随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1,mol/L,氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。,RNP,在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14,mol/L,氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，,常用此法分离这两种核蛋白。,细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方,法有三种：,机械方法：超声波处理法、研磨法、,匀浆法；,化学试剂法：用,SDS,处理细胞；,酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可,使细胞壁破碎。,2.细胞的破碎,由于高等动物,DNA,主要存在于细胞核与线粒体中，所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）：,破碎细胞难；从处死动物,分离组织器宫到破碎细胞费时长。在此时期间,DNA,可能会被,DN,ase,降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎,即使是较易破碎的肝,肾等组织也往往使用组织匀浆器，易造成,DNA,断裂。,分子量大，一般比细菌的大23个数量级，比病毒的大45个数量。对不同生物材料，要根据具体情况选择适当的分离提取方法。,3.,DNA,提取的几种方法,(1).浓盐法,利用,RNP,和,DNP,在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1,M,氯 纳提取化钠抽提,得到的,DNP,粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而,DNA,位于上层水相中,用2倍体积95%乙醇可将,DNA,钠盐沉淀出来.,也可用0.15,MNaCL,液反复洗涤细胞破碎液除去,RNP,再以1,MNaCL,提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿-异醇法除去蛋白.,两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.,以稀盐酸溶液提取,DNA,时,加入适量去污剂,如,SDS,可有助于蛋白质与,DNA,的分离。在提取过程中为抑制组织中的,DNase,对,DNA,的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15,MNaCL,0.015M,柠檬钠,并称,SSC,溶液,提取,DNA.,（2）.阴离子去污剂法:,用,SDS,或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取,DNA .,由于细胞中,DNA,与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取,DNA.,（3）.,苯酚抽提法:,苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了,DNase,的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与,DNA,联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而,DNA,溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含,DNA,的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀,DNA 。,此时,DNA,是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的,DNA,保持天然状态 .,（ 4）.水抽提法:,利用核酸溶解于水的性质,将组织细胞破碎后,用低盐溶液除去,RNA，,然后将沉淀溶于水中，使,DNA,充分溶解于水中,离心后收集上清液.在上清中加入固体氯化钠调节至2.6,M.,加入2倍体积95%乙醇,立即用搅拌法搅出.然后分别用66%,80%和95%乙醇以及丙铜洗涤,最后在空气中干燥,既得,DNA,样品.此法提取的,DNA,中蛋白质含量较高,故一般不用.为除蛋白可将此法加以改良,在提取过程中加入,SDS.,二. 从猪脾中提取,DNA,1. 操作步骤:,取鲜猪脾,去脂、血,称取10,g,用预冷的1,SSC,溶液洗2次，剪碎。,按睥：1,SSC=1; 5W/V,加入50,ml,预冷的1,SSC，,用高速组织,捣碎机破碎8次,每次5秒,中间间隔30秒。,将匀浆液放在烧杯中， 于冰盐浴中冷却30分钟。4000转/分钟离心10分钟。充掉上清。沉淀物中再加2倍体积的1,SSC,搅匀，离心，弃上清，重复2次。,将所得沉淀悬于5倍体积的,PH8.0、0.15MNaCL0.1Na,2,MEDTA,溶液中。边搅拌边漫漫滴加5%,SDS,最终浓度达1%为止。然后加入固体氯化钠使其最终浓度达1,mol/L，,继续搅60分钟，以确保氯化钠全溶。所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿异戊醇，激烈振荡20分钟，4000,r,离心20分钟，上层水相取出后倒入烧杯，以同积氯仿异戊醇重复去蛋白2次。,取出水相于烧杯中，逐渐加入2倍体积95%乙醇，玻棒搅动，,DNA,纤维绕于璃玻棒上后挤干，用70%乙醇洗,DNA,纤维2次，用95%乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并挤干,。,2. 实验材料，仪器和试剂：,（1）,实验材料：新鲜猪脾：,（2）仪器：量筒：110、3100烧杯：2100，2250；磨,口锥形瓶：1250、1500；吸管：11、110；滴管、玻棒、,离心机、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。,（3）,试剂：,20,SSC：175.2gNaCL，88.2g,柠檬酸钠2,H,2,O，PH=7.0,加,水至1000,ml；,1SSC，0.1SSC,由做相应的稀释得来；,NaCL-Na,2,EDTA,液：8.77,gNaCL，3.72gNa,2,EDTA,溶于,800,ml,蒸馏水中，用固体,NaOH,调,PH=8,后定容至1000；,5%,SDS（W/V）：6gSDS,溶于100,ml45%,乙醇中；,氯仿-异戊醇=24：1（体积比）, 其他:95%乙醇，盐冰.,数据:,DNA,重,产率:,待测液中测得的核酸,g,数,DNA%= 100,待测液中制品的,g,数,二苯胺显色法测定DNA含量,强酸、加热条件下，可以使,DNA,中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中2脱氧核糖在酸性环境中成为,羟基,酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成蓝色化合物，在595,nm,处有最大吸收。,DNA,在40-400,g,范围内光密度与,DNA,浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干扰也显著降低。当样品含少量,RNA,时不影响测定，而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与二苯胺形成各种有色物质，干扰测定,。,、二苯胺试剂：使用前称取0.8,g,二苯胺（需在70%乙醇试剂中重结晶2次)，溶于180,ml,冰乙酸中，再加入8,ml,过氯酸（60%以上），混匀待用，临用前加入0.8,ml 1.6%,乙醛溶液，所配试剂应为无色。,每组需56,ml,共需2800,ml,、DNA,标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准,DNA,以0.01,N NAOH,配成200微克毫升的标准液。,每组需12,ml,共需600,ml,、1.6%,乙醛：取47%乙醛3.4,ml，,加重蒸水定容至100,ml（,放于冰箱中，一周之内可以使用）。,共需70,ml,、,(测样品液：准确称取猪脾,DNA,或用紫外分光法中剩下的,DNA,液配成10微克毫升的溶液。,每组需4,ml,共需200,ml,操作方法： 1.,DNA,标准曲线的制定： 取10支试管，分成2组，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0,mlDNA,标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为2,ml。,另取2只试管，各加2,ml,蒸馏水作为对照。然后各加入4,ml,二苯胺试剂，混匀。于60 恒温水浴中保温1,h，,冷却后于595,nm,处进行比色测定。取两管平均值，以,DNA,浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 制品的测定： 取2支试管，各加2,ml,待测液（内含,DNA,应在标准曲线的可范围之内）和4,ml,二苯胺试剂，摇匀。其于操作同标准曲线的制作。 3.根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应该光吸收值,DNA,的含量，计算出制品中的百分含量。,1.为什么在低温下进行？,2.,分别加柠檬酸钠和,EDTA,的作用 ?,3.加,SDS,的作用？,4.加,NaCL,的作用，为什么要加到1,mol/L?,5.,加入异戊醇有什么作用？,