《卫生化学》课件14.高效液相色谱

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第17章 高效液相色谱,17.1 概述,17.2,HPLC,仪器,包括： 高压输液装置; 进样系统; 分离系统; 检测系统;辅助系统,17.3 流动相和固定相简介,17.4 高效液相色谱方法各论,分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱和亲和色谱,17.1 概述,高效液相色谱,(,HPLC),是以溶剂液体为流动相的色谱方法。按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外，还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。,早期液相色谱，包括,Tswett,的工作，都是在直径,15,cm,长,50500,cm,的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在,150200,m,范围内。即使这样，流速仍然很低,(BC,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,时间，,min,固定相：,C1,固定相：,C8,固定相：,C18,硅胶-烷基键合相中烷基链长对反相色谱分离的影响,1-尿嘧啶；2-苯酚；3-乙酰苯；4-硝基苯；5-苯甲酸甲酯；6-甲苯,可见：反相键合色谱中，键合相碳链越长，分离效果越好。,二、离子交换色谱,此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、氨基酸、核酸等。,1. 原理：利用不同等测离子对固定相的亲和能力（或离子交换能力）的差别来实现分离的。待测离子与离子交换树脂固定相上带电荷基团或游离的离子发生可逆交换反应：,对阳离子，滞留顺序为：,Fe,3+, Ba,2+, Pb,2+, Sr,2+, Ca,2+, Ni2+, Cd,2+, Cu,2+, Co,2+, Zn,2+, Mg,2+, UO,2,2+, Tl,+, Ag,+, Cs,+, Rb,+, K,+, NH,4,+, Na,+, H,+, Li,+,对阴离子，滞留顺序为：,柠檬酸根,SO,4,2-, C,2,O,4, I,-, HSO,4,-, NO,3,-, CrO,4,2-, Br,-, SCN,-, Cl,-, HCOO,-, CH,3,COO,-, OH,-, F,-,思考：待测阳离子电荷越小、其水合离子的半径越大，则越先出峰？对吗？,2. 固定相,按离子交换剂类型分四种：,按固定相制作方法可分为：,多孔型离子交换树脂(包括微孔型和大孔型)；,表面多孔型(包括薄膜型）离子交换树脂；,离子交换键合型。,1）多孔型：聚苯乙烯+二乙烯苯交联，分微孔型和大孔型。交换基团多交换容量大，稳定。但易溶胀，传质慢、柱效低、分析速度慢。,2）表面多孔型：,薄膜型=惰性核+树脂薄层,(1-2,m),多孔型=惰性核+硅胶微球+树脂薄层。克服了多孔型离子交换树脂的不足，但交换容量低，柱子易超负荷。,3）离子交换键合相：利用化学反应将离子交换基团键合到惰性载体表面。载体可以是薄壳玻珠，也可以是多孔硅胶微粒。使用后者为载体，可得到性能稳定、耐压、高柱效的柱子。,微孔型 大孔型,微孔,微孔,薄膜型 表面多孔型,离子交换层,惰性核,惰性核,离子交换剂硅胶层涂覆,3. 流动相,离子交换色谱流动相为盐类缓冲溶液(有一定,pH,和离子强度),，通过改变,pH,、,缓冲剂类型、离子强度、加入有机试剂和配位剂等条件来控制分配比,k,，,改变交换剂的选择性，进而影响样品待测物的分离。,pH,值：,影响酸或碱的离解平衡，控制组分离子形式所占的分数。当组分以分子形式存在时，则不被保留；离子分数越高，保留值越大。常用的有柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐和氨水等。,离子强度,I,：,对保留值的影响比,pH,更大。组分保留值受流动相中盐类总浓度控制。增加外加阴或阳离子将增加它们对,R,+,或,R,-,的竞争能力，使组分保留值减小。通过加入不同种类的盐，可影响柱的选择性，因为不同物质对交换剂的亲和能力不同。,有机溶剂：,外加有机溶剂通常减小组分的保留值。其极性越小，保留值越小。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙腈和二氧杂环已烷等。,配离子,L,：,当大量,L、,组分,X,随流动相进入柱后，发生配位剂交换：,RM-L+X, RM-X+L,该法用于分离各种氨基酸或碱类。,思考：离子交换色谱法中，流动相常以无机盐的缓冲液为流动相。请问缓冲液的,pH,值及离子强度对分离各有何影响？,三、离子色谱,离子色谱(,IC,),是,70,年代发展的新方法。其分离原理与离子交换色谱原理一样，只是流出的各种离子用电导检测器检测。但由于流动相都是强电解质，其电导率比待测离子约高,2,个数量级，这种强背景电导会完全掩盖待测离子信号。,为解决此问题，,1975,年,Small,提出，在离子交换柱之后，再串结一根抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相，从而可用电导检测器检测各种离子的含量。,例如：分析阳离子时，以无机酸为流动相，抑制柱为高容量的强碱性阴离子交换树脂，则发生下列反应：,R,+,OH + HCl,(,流动相),R,+,Cl,-,+ H,2,O,R,+,OH + MCl,(,待测物) ,R,+,Cl + M,+,OH,-,可见，不仅大量酸转化为低电导的水，而且待测离子转化为具有更大淌度的碱。,该法的不足之处在于：抑制柱要定期再生、谱峰在经过抑制柱后会展宽，降低分离度。因此有人提出了使用电导率很低的溶液(如苯甲酸盐稀溶液)作流动相。,思考：,IC,分离中，何为抑制柱？分析阴离子时，抑制柱中应填充何种离子交换树脂？,四、离子对色谱法（,IPC）,离子色谱对色谱主要用来分离强极性有机酸和有机碱。,1. 原理：将与待测物离子,A,电荷相反的离子,B（,称为对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子与对离子形成离子对,AB，,该,AB,离子对,的性质与,A,离子,或,B,离子,的性质不同，即间接改变了待测离子的保留特性。,例如：固定相为非极性键合相，流动相为水溶液，于流动相中加入与待测离子,A,-,有相反电荷的离子,B,+,：,由于离子对,AB,具有疏水性，因而被非极性固定相提取。其它待测离子,A,1,，A,2,，A,3,.,因与,B,离子间的成对能力不同，而形成不同疏水性的离子对，使得各待测物在柱内的保留值不同，从而达到分离的目的。,思考：有一强极性有机酸混合物，若用离子对色谱法分离，请问在流动相中应加入阴离子还是阳离子来开成离子对？,五、尺寸排阻色谱法,尺寸排阻色谱又称凝胶(渗透)色谱，主要用于大分子的分子分离。它是基于待测物分子的尺寸和形状不同来实现分离的。,1. 分离原理：固定相为化学惰性的多孔凝胶，它类似于分子筛，但孔径更大。凝胶内有一定大小的空穴，分子体积大的待测物不能渗入孔穴中而被排阻，较早地被淋洗出来，中等的部分渗透，小分子则完全渗透，最后流出色谱柱。即待测物分子按分子大小(分子量大小)先后从柱中流出。,2. 固定相,3. 流动相的要求：能溶解样品且与凝胶相似(润湿凝胶)、粘度小(增加扩散速度,)。,六、亲合色谱,主要用于生物大分子与固定相之间的特异亲合力进行选择性分离及纯化的方法。,分离原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称为间隔臂），然后再连接上配基，如酶、抗原或激素。当含有复杂混合试样的流动相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲合力特性的生物大分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被洗出；随后，改变流动相,pH,或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形式洗脱出来。,特点：选择性过滤、纯化效果好。,七、色谱分离方法的选择,