十一抗生素类药物分析

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,Your company slogan,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,第十一章 抗生素类药物的分析,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,在低微浓度下即可对某些生物（病原微生物）的生命活动有特异抑制作用的化学物质的总称,内酰胺类,氨基糖苷类,四环素类,大环内酯类,多烯大环类,多肽类,1. 抗生素（,antibiotics）,2. 分 类,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,一、概 述,化学纯度较低,活性组分易发生变异,稳定性差,3. 来 源,4. 抗生素的特点,化学合成,半合成,生物合成（发酵）,生产工艺复杂,发酵过程不易控制，易受污染,原因,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,一、概 述,采用,生物学法,与,物理化学法,鉴别：理化方法、微生物法,检查：水分、异常毒性、热原、细菌内毒素、降压物质等,含量/效价测定：,微生物法 ：,与临床疗效吻合，灵敏度高，但操作复杂费时；,理化方法：,准确度与专属性较高，且操作简便，但与临床疗效有偏差,5. 抗生素质量分析,一、概 述,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,1.,化学结构,包括青霉素类和头孢菌素类,青霉素类：6-,APA,为母核 头孢菌素类：7-,ACA,为母核,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、,内酰胺类,酸性较强（,pKa 2.5-2.8）,临床常用其碱金属盐,（水溶性好）,酸性(羧基),有多个手性碳,旋光性,青霉素类：苯环取代基,头孢菌素类：母核有共轭结构,UV（,共轭）,干燥条件较稳定，溶液不稳定,稳定性(内酰胺),2、主要,理化性质,降解,失效,氧化剂、酸、碱,酶、金属离子、,青霉素,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、,内酰胺类,2、,主要理化性质,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、,内酰胺类,1）羟肟酸铁反应：,内酰胺类 羟肟酸 显色,2）茚三酮反应,-,氨基 蓝紫色,3）双缩脲反应,内酰胺类 紫色,4）光谱法（,UV、NMR）,5）,色谱法（,HPLC、TLC）,NH,2,OHHCl,NaOH,Fe,3+,H,+,茚三酮,碱性酒石酸铜,呈色反应,3,、,鉴 别,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、,内酰胺类,3,、,鉴 别,-,头孢利定的,NMR,鉴别法,(,JP14),NMR,鉴别法,单峰信号,取本品50,mg,溶于0.5,ml,重水中，测定,NMR,光谱时，应显示,多重峰信号,多重峰信号,= 3.8,附近,= 6.97.5,= 7.99.0,2,3,5,强度比,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、,内酰胺类,3,、,鉴 别,-,头孢氨苄鉴别的,TLC,条件,CHP（2000）,5,mg/ml 2l,硅胶,G,0.1mol/L,枸橼酸液-0.2,mol/LNa2HPO4-,丙酮 (120:80:3),0.1% 茚三酮溶液显色,USP（24）,25,mg/ml 5l,硅胶,醋酸乙酯-水-乙腈-冰,HAc (48:18:14:14),短波长,UV,光检出,BP（1999）,0.4%(,W/V) 1l,硅烷化硅胶,HF254,15.4% NH4Ac(pH6.2)-,丙酮(85:15),254,nm,检出,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、,内酰胺类,4,、,特殊杂质检查-聚合物、有关物质、异构体等,色谱条件与系统适用性试验,测定法,头孢他啶中聚合物测定,头孢呋辛酯中,有关物质和异构体的检查,色谱条件与系统适用性试验,异构体和有关物质,举 例：,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,二、,内酰胺类,头孢他啶中聚合物测定,-,色谱条件与系统适用性试验,葡聚糖凝胶,G-10,理论板数应不低于900，,拖尾因子在0.751.5,254,nm,检 测,流动相,A：,含3.5%硫酸铵,的0.01,mol/L,磷酸盐缓冲液,蓝色葡聚糖,2000,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢他啶中聚合物测定,-,色谱条件与系统适用性试验,葡聚糖凝胶,G-10,峰面积的,RSD,应小于5.0%,254,nm,检 测,流动相,B：,0.01%,十二烷基,硫酸钠溶液,头孢他啶,对照品溶液,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢他啶中聚合物测定,-,测定法,葡聚糖凝胶,G-10,254,nm,检 测,流动相,A：,含3.5%硫酸铵,的0.01,mol/L,磷酸盐缓冲液,头孢他啶样品,（20,mg/ml）,外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%,A,S,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢他啶中聚合物测定,-,测定法,葡聚糖凝胶,G-10,254,nm,检 测,流动相,B：,0.01%,十二烷基,硫酸钠溶液,头孢他啶,对照品溶液,A,R,外标法计算，本品含头孢他啶聚合物以头孢他啶计不得超过0.3%,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢呋辛酯中,有关物质和异构体,的检查,头孢呋辛酯,A，B,异构体之间、头孢呋辛酯,A,异构体与头孢呋辛酯2-异构体之间的分离度应大于1.5,；,色谱条件,：,ODS,分析柱；,0.2,mol/L,磷酸二氢铵-甲醇（62:38）为流动相；,流速1,ml/min；,检测波长278,nm。,系统适用性试验,：,理论板数按头孢呋辛酯,A,异构体峰计算，应不低于1500。,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,40,0,20,60,0,30,20,10,时间(,min),峰高(,mAU),6,5,4,A,异构体,B,异构体,1,13.954,11.919,2.401,B,异构体峰的相对保留时间约为0.85，,A,异构体峰的相对保留时间为1.0,。,供试品色谱图中,A,异构体峰的面积与,A、B,异构体峰的面积和之比应为0.480.55,。,头孢呋辛酯中,有关物质和异构体,的检查,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,异构体,供试品溶液：0.2,mg/ml(,流动相溶）,对照溶液:供试品溶液,，加流动相稀释成,6,g/ml,对照溶液进样20,l ，,调节仪器灵敏度，使主成分峰高约为记录仪满量程的10%,取供试品溶液和对照品溶液各20,l，,分别注入液相色谱仪，,记录色谱图至主峰保留时间的2.5倍,供试品溶液如显杂质峰，量取各杂质峰面积的和，不得大于对照溶液主峰的面积,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,头孢呋辛酯中,有关物质和异构体,的检查,有关物质,5,、,含量测定,-,碘量法（,ChP2000）,二、,内酰胺类,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,原理：青霉素与头孢菌素本身不与碘反应，但其,碱性降解产物可消耗碘,青霉素族,头孢菌素族,NaOH,水解,4,I,2,H,+,8,I,-,I,2,+2Na,2,S,2,O,3,2NaI + Na,2,S,4,O,6,定量过量,剩 余,5,、,含量测定,-,碘量法（,ChP2000）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,反应分两步进行：,水解反应,(按化学计算量进行),氧化-还原反应,(无定量关系，受温度、,pH,值和时间等因素影响，,应严格控制反应条件并采用标准品平行对照测定),5,、,含量测定,-,碘量法（,ChP2000）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,因样品中杂质会消耗碘，故应作空白试验。,加入样品，不加碱,；,其余试剂（醋酸盐缓冲液，碘液，硫代硫酸钠）都要加碱。,空白试验:,空白试验与经典空白试验不同：,5,、,含量测定,-,碘量法（,ChP2000）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,试验条件:（,I,2,氧化）,弱酸性（,pH4.5）,20分钟后，,耗碘量随时间的变化较小,碱,I,2, IO,3,-,+ I,-,酸 某些药物与碘生成复盐沉淀,温度（2426）,温度,38,时,未水解的供试品亦消耗碘,反应时间：（ 20分钟）,5,、,含量测定,-,碘量法（,ChP2000）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,含量,对照品,V,样空,-,V,样,W,对,V,对空,-,V,对,W,样,灵敏度高：样品 : 碘 = 1 : 8,反应条件、实验操作要求高,1份含量,V,对,、,V,对空,V,样,、,V,样空,加试剂次序、反应时间、滴定速度相同,特 点：,5,、,含量测定,-,电位配位滴定法（汞量法）,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,原理：青霉素不与汞盐反应，其碱性降解产物可与,Hg,2+,络和。,Hg,+,+ 2R-SH (RS),2,Hg + 2H,+,方法说明：,a、,空白试验与碘量法类似，加样品，不加,NaOH,b、,与碘量法相比，汞量法不需对照试验,5,、,含量测定,-,其他常用方法,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,酸碱滴定法：应用广泛,硫醇汞盐法,羟肟酸比色法,HPLC,法：应用广泛,咪唑,HgCl,2,（,max,324345nm）,青霉素 青霉烯酸硫醇汞盐,NH,2,OH,H,+,Fe,3+,内酰胺类 红色,5,、,含量测定,（例）,-,阿莫西林克拉维酸钾片,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,填充剂,流动相,检测波长,峰形,阿莫西林峰与克拉维酸峰的分离度应大于3.5,色谱条件与系统适用性试验,十八烷基硅烷键合硅胶,磷酸盐缓冲液-甲醇(95:,5,),流速为0.7,ml/min；,检测波长为220,nm,5,、,含量测定,（例）,-,阿莫西林克拉维酸钾片,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,取本品10片，置1000,ml,量瓶中，加水适量，振摇使溶解，加水稀释至刻度，摇匀，精密量取10,ml，,置50,ml,量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液10,l,注入液相色谱仪，记录色谱图；,另取阿莫西林对照品与克拉维酸对照品各适量，加水溶解，,制成每1,ml,中含阿莫西林0.5,mg,和克拉维酸0.25,mg,的混合溶液,，同法测定。,按外标法以峰面积分别计算供试品中,C16H19N3O5S,和,C8H9NO5,的含量。,测 定 法 ：,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,1.,化学结构,三,、,氨基糖苷类,都是以,氨基环醇,与,氨基糖,缩合而成的,苷,；,分子结构中都含有多羟基；,均为碱性抗生素；,链霉素,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,临床应用其硫酸盐,碱性(氨基),（糖）：有多个手性碳,旋光性(糖),水 溶 性,溶解度(氨基、羟基),强酸、碱条件均可水解,稳定性(苷),2、主要,理化性质,三,、,氨基糖苷类,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,3,、,鉴 别,三,、,氨基糖苷类,茚三酮反应：具羟基胺类，,-,氨基酸性质,链霉素 +,水和茚三酮 蓝紫色,链霉素,N-,甲基葡萄糖胺,N-,甲基葡萄糖胺（,Elson-Morgan）,反应：,红 色,水解,对二甲氨基苯甲醛,乙酰丙酮,OH,-,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,OH,-,重排,Fe,3+,8-羟基喹啉,NaOBr,OH,-,水解,坂口（,Sakaguchi）,反应：(链霉胍特有）,麦芽酚（,Maltol),反应：(链霉糖特有）,三,、,氨基糖苷类,-鉴别,链霉素 麦芽酚 紫红色,链霉素 链霉胍,橙红,硫酸盐反应,或,-,萘酚,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,4,、,检 查,-,来 源：,发酵中产生,BP:,薄层色谱法（杂质对照品法）,要求：,NC2 2000，C2a,峰和,C2,峰的分离度应符合要求，重复进样,RSD2.0%,三,、,氨基糖苷类,链霉素中链霉素,B,的检查,庆大霉素,C,组分测定（系统适用性试验）,色谱柱：,ODS,流动相：,H,2,O-HAc-MeOH,配制的庚烷磺酸钠溶液(0.2,M)，,必要时调节甲醇的含量。,检测波长：,330,nm（,邻苯二甲醛柱前衍生）,4,、,含 量 检 测,三,、,氨基糖苷类,氨基糖苷类 含量检测,微生物法、,HPLC,法等,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四,、,四环素类,1.,化学结构,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四,、,四环素类,-,OH：,酸性,N(CH,3,),2,：,碱性,与酸、碱均可成盐,临床多用盐酸盐,两 性,旋光性,易发生异构化，降解等反应，性质不稳定,稳定性,酚羟基、烯醇基与,Ca,2+,、Mg,2+,络合显色,与金属离子络合,2、主要,理化性质,UV,和荧光,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四,、,四环素类,2,.,主要理化性质,碱 性,C,环开环，形成内酯 异四环素,弱酸性（,pH2-6） A,环,C-4,异构化 差向四环素,酸性（,pH 2） C,环脱水 脱水四环素,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四,、,四环素类,A,A,pH2.06.0,差向异构体,D,D,D,C,B,B,C,B,C,脱水四环素类,异四环素,OH,-,四,、,四环素类,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,四,、,四环素类,3,.,鉴 别,1）浓硫酸反应,2）FeCl3反应： （酚羟基） 显红色褐色,3） TLC、HPLC,4）荧光：（含共轭双键）紫外灯照射下产生不同颜色荧光,ChP、USP,： HPLC,法,JP,：,比色法,4,.,检 查,TLC、HPLC法,杂质吸收度（降解产物颜色较深）,5,.,含 量,中 国 药 科 大 学 药 学 院 药 分 教 研 室,五,、,高分子杂质的检查,内源性：药物自身聚合物,来源于生产过程、贮存过程、使用不当,外源性：蛋白、多肽、多糖及其与药物的结合物,来源于发酵过程,临床应用其硫酸盐,高分子杂质,凝胶色谱法：葡聚糖凝胶,Sephadex G-10,杂质控制方法,