实验技术理论－生物大分子的制备ppt课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物大分子的制备,1,2.1 概述,在自然科学，尤其是生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。,2,与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点：,生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。,许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。,许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。,生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、,pH,值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。,3,生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：,确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新的物质。,建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。,通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。,生物材料的破碎和预处理。,分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。,生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或,HPLC,和毛细管电泳都是一个峰。,产物的浓缩，干燥和保存。,4,分析测定的方法主要有两类：,即生物学和物理、化学的测定方法。,生物学的测定法主要有：酶的各种测活方法、蛋白质含量的各种测定法、免疫化学方法、放射性同位素示踪法等；,物理、化学方法主要有：比色法、气相色谱和液相色谱法、光谱法（紫外可见、红外和荧光等分光光度法）、电泳法、以及核磁共振等。,实际操作中尽可能多用仪器分析方法，以使分析测定更加快速、简便。,5,要了解的生物大分子的物理、化学性质主要有：,在水和各种有机溶剂中的溶解性。,在不同温度、,pH,值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性。,固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。,各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。,其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性。,对其他生物分子的特殊亲和力。,6,制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和与其他分子的亲和性等。,各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：,利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂沉淀、层析和结晶等；,将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、超滤等。,目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是电泳、层析和高速与超速离心。,7,2.2 生物大分子制备的前处理,2.2.1,生物材料的选择,制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。,选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。,动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分，绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。,植物要先去壳、除脂。,微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。,生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则需深度冷冻保存。,8,2.2.2,细胞的破碎,不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。,(1),机械法：,1) 研磨：将剪碎的动物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。,2),组织捣碎器：这是一种较剧烈的破碎细胞的方法，通常可先用家用食品加工机将组织打碎，然后再用,10000,r/min,20000r/min,的内刀式组织捣碎机,(,即高速分散器,),将组织的细胞打碎。,9,(2),物理法：,1),反复冻融法：将待破碎的细胞冷至,15,到,20,，然后放于室温,(,或,40,),迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。,2),超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长一些。,3),压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在,1000,10,5,P,a,2000,10,5,P,a,的高压下使细胞悬液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。,4),冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可用此法。在,90,左右维持数分钟，立即放入冰浴中使之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。,10,(3),化学与生物化学方法：,1),自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的,pH,和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。,2),溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。,3) 酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，于37，,pH8，,处理15分钟，可以专一性地将细胞壁分解。,4),有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或,SDS,（,十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。,11,2.2.3,生物大分子的提取,“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。,影响提取的因素主要有：,目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小；,由固相扩散到液相的难易；,溶剂的,pH,值和提取时间等。,通常：,极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂；,碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；,温度升高，溶解度加大；,远离等电点的,pH,值，溶解度增加。,提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和保持其生物活性。,12,水溶液提取：,蛋白质和酶的提取一般以水溶液为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。用水溶液提取生物大分子应注意的几个主要影响因素是：,1) 盐浓度（即离子强度）：,离子强度对生物大分子的溶解度有极大的影响，有些物质，如,DNA-,蛋白复合物，在高离子强度下溶解度增加。,绝大多数蛋白质和酶，在低离子强度的溶液中都有较大的溶解度，如在纯水中加入少量中性盐，蛋白质的溶解度比在纯水时大大增加，称为“盐溶”现象。盐溶现象的产生主要是少量离子的活动，减少了偶极分子之间极性基团的静电吸引力，增加了溶质和溶剂分子间相互作用力的结果。,为了提高提取效率，有时需要降低或提高溶剂的极性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其极性降低，增加离子强度（如加入,KCl,、,NaCl,、,NH,4,Cl,或,(,NH,4,),2,SO,4,）,可以增加溶液的极性。,13,2),pH,值：蛋白质、酶与核酸的溶解度和稳定性与,pH,值有关。过酸、过碱均应尽量避免，一般控制在,pH=68,范围内，提取溶剂的,pH,应在蛋白质和酶的稳定范围内，通常选择偏离等电点的两侧。,3) 温度：为防止变性和降解，制备具有活性的蛋白质和酶，提取时一般在05的低温操作。,4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制剂或调节提取液的,pH、,离子强度或极性等方法使相应的水解酶失去活性，防止它们对欲提纯的蛋白质、酶及核酸的降解作用。,14,5) 搅拌与氧化：搅拌能促使被提取物的溶解，一般采用温和搅拌为宜，速度太快容易产生大量泡沫，增大了与空气的接触面，会引起酶等物质的变性失活。因为一般蛋白质都含有相当数量的巯基，有些巯基常常是活性部位的必需基团，若提取液中有氧化剂或与空气中的氧气接触过多都会使巯基氧化为分子内或分子间的二硫键，导致酶活性的丧失。在提取液中加入少量巯基乙醇或半胱氨酸以防止巯基氧化。,15,有机溶剂提取,一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶难溶于水、稀盐、稀酸、或稀碱中，常用不同比例的有机溶剂提取。,常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性。,有些蛋白质和酶既溶于稀酸、稀碱，又能溶于含有一定比例的有机溶剂的水溶液中，在这种情况下，采用稀的有机溶液提取常常可以防止水解酶的破坏，并兼有除去杂质提高纯化效果的作用。,例如，胰岛素,。,16,2.3 生物大分子的分离纯化,由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。,为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。常用的分离纯化方法和技术有：,沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。本章以介绍沉淀法为主。,17,2.3.1 沉淀法,沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。,其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的,pH,值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。,18,在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：,中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。,有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。,选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定,pH,值下易变性的杂蛋白。,等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。,有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用,PEG,聚乙二醇（,Polyethyene glycol）,作为沉淀剂。,19,2.3.1.1 中性盐沉淀（盐析法）,在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。,盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：,成本低，不需要特别昂贵的设备。,操作简单、安全。,对许多生物活性物质具有稳定作用。,20,中性盐沉淀蛋白质的基本原理,蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的,COOH、NH2,和,OH,都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1,nm100nm,颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。盐析示意图如下页“图 4”所示。,21,22, 中性盐的选择,常用的中性盐中最重要的是（,NH4）2SO4，,因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：,1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（04）进行。由下表可以看到， 硫铵在0时的溶解度，远远高于其它盐类：,表,2-1,几种盐在不同温度下的溶解度（克,/100,毫升水）,0,20,80,100,（,NH4,),2,SO4 70.6 75.4 95.3 103,Na,2,SO4 4.9 18.9 43.3 42.2,NaH,2,PO4 1.6 7.8 93.8 101,23,2),分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵,盐析，一步就可以除去,75,的杂蛋白，纯,度提高了四倍。,3),不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的,作用。有的酶或蛋白质用,2,3,mol/L,浓度,的,（,NH4,）,2,SO4,保存可达数年之久。,4),价格便宜，废液不污染环境。,24,盐析的操作方法,最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，接近计划饱和度时，加盐的速度更要慢一些，尽量避免局部硫酸铵浓度过大而造成不应有的蛋白质沉淀。盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后再离心与过滤。,在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓度硫酸铵常用过滤方法。,各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可由附录中查出。,25,盐析曲线的制作,如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。具体操作方法如下(讲义,p39)：,蛋白质量(,mg),或酶活力,10 20 30 40 50 60 70 80 90 100,硫铵饱和度,26,盐析的影响因素,1) 蛋白质的浓度：高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度沉淀，若蛋白质浓度过高，易产生各种蛋白质的共沉淀作用。低浓度的蛋白质，共沉淀作用小，但回收率降低。较适中的蛋白质浓度是,2.5,3.0,，相当于,25,mg/mL,30mg/mL,。,2) pH,值对盐析的影响：在等电点处溶解度小，,pH,值常选在该蛋白质的等电点附近。,3),温度的影响：对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。一般情况下，可在室温下进行。但对于某些对温度敏感的酶，要求在,0,4,下操作，以避免活力丧失。,27,2.3.1.2 有机溶剂沉淀法,基本原理,有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：,降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。,由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。,28,有机溶剂沉淀法的优点是：,分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。,沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。,其缺点是对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。,有机溶剂的选择和浓度的计算,用于生化制备的有机溶剂的选择首先是要能与水互溶。沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。,为了获得沉淀而不着重于进行分离，可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机溶剂沉淀。,29,有机溶剂沉淀的影响因素,1),温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断搅拌以免局部过浓。,一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性越高。,2),样品浓度：低浓度样品回收率低，要使用比例更大的有机溶剂进行沉淀。高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。,通常使用,5,mg/mL,20mg/mL,的蛋白质初浓度为宜。,30,3),pH,值：选择在样品稳定的,pH,值范围内，通常是选在等电点附近，从而提高此沉淀法的分辨能力。,4),离子强度：盐浓度太大或太小都有不利影响，通常盐浓度以不超过,5,为宜，使用乙醇的量也以不超过原蛋白质水溶液的倍体积为宜，少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。,沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有机溶剂的含量，如若必要可以装透析袋透析脱有机溶剂，以免影响样品的生物活性。,31,2.3.1.3,选择性变性沉淀法,这一方法是利用生物大分子与非目的生物大分子在物理化学性质等方面的差异，选择一定的条件使杂蛋白等非目的物变性沉淀而得到分离提纯。,热变性,利用生物大分子对热的稳定性不同，加热升高温度使非目的生物大分子变性沉淀而保留目的物在溶液中。,表面活性剂和有机溶剂变性,使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感性强的杂蛋白变性沉淀。通常在冰浴或冷室中进行。,选择性酸碱变性,利用对,pH,值的稳定性不同而使杂蛋白变性沉淀。通常是在分离纯化流程中附带进行的分离纯化步骤。,32,2.3.1.4,等电点沉淀法,利用具有不同等电点的两性电解质，在达到电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。,由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。,此法主要用于在分离纯化流程中去除杂蛋白，而不用于沉淀目的物。,33,2.3.1.5,有机聚合物沉淀法,有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。其中应用最多的是,“聚乙二醇”【,HOCH,2,(CH,2,OCH,2,),n,CH,2,OH (n,4)】( Polyethylene Glycol,简写为,PEG ),，,它的亲水性强，溶干水和许多有机溶剂，对热稳定，有广泛围的分子量，在生物大分子制备中，用的较多的是分子量为,6000,20000,的,PEG,。,本方法的优点是：,操作条件温和，不易引起生物大分子变性。,沉淀效能高，使用很少量的,P“EG,即可以沉淀相当多,的生物大分子。,沉淀后有机聚合物容易去除。,34,2.3.2,透析,自,Thomas Graham 1861,年发明透析方法至今已有一百多年。透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。,透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为“保留液”，袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截留分子量,MwCO,通常为,1,万左右。,用,1,BaCl,2,检查,(,NH,4,),2,SO,4,，,用,1,AgNO,3,检查,NaCl,、,KCl,等。,35,2.3.3,超滤,超过滤即超滤，自,20,年代问世后，直至,60,年代以来发展迅速，很快由实验室规模的分离手段发展成重要的工业单元操作技术。超滤现已成为一种重要的生化实验技术，广泛用于含有各种小分子溶质的各种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓缩、分离和纯化。,超滤是一种加压膜分离技术，即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到了部分的纯化。,36,37,超滤根据所加的操作压力和所用膜的平均孔径的不同，可分为,微孔过滤、超滤和反渗透三种。,微孔过滤,所用的操作压通常小于,4,10,4,P,a,，,膜的平均孔径为,500,埃,14,微米（,1,微米,10,4,埃）,，用于分离较大的微粒、细菌和污染物等。,超滤,所用操作压为,4,10,4,P,a,7,10,5,P,a,，,膜的平均孔径为,10100,埃,，用于分离大分子溶质。,反渗透,所用的操作压比超滤更大，常达到,35,10,5,P,a,140,10,5,P,a,，,膜的平均孔径最小，一般为,10,埃,以下，用于分离小分子溶质，如海水脱盐，制高纯水等。,38,超滤技术的优点是,操作简便，成本低廉，不需增加任何化学试剂,，尤其是超滤技术的实验条件温和，与蒸发、冰冻干燥相比没有相的变化，而且不引起温度、,pH,的变化，因而可以防止生物大分子的变性、失活和自溶。,在生物大分子的制备技术中，超滤主要用于生物大分子的脱盐、脱水和浓缩等。,超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。对于蛋白质溶液，一般只能得到,10,50,的浓度。,39,超滤技术的关键是膜。,常用的膜是由,乙酸纤维,或,硝酸纤维,或此二者的混合物制成。近年来发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在,pH 1,14,都是稳定的，且能在,90,下正常工作。超滤膜通常是比较稳定的，能连续用,1,2,年。,超滤膜的基本性能指标：,水通量,（,cm,3,/(cm,2,h),）；,截留率,（以百分率表示）；,化学物理稳定性,（包括机械强度）等。,超滤装置由若干超滤组件构成。分为,板框式,、,管式、螺旋卷式和中空纤维式,四种主要类型。,由于超滤法处理的液体多数是含有水溶性生物大分子、有机胶体、多糖及微生物等。这些物质极易粘附和沉积于膜表面上，造成严重的浓差极化和堵塞，这是超滤法最关键的问题，要克服浓差极化，通常可加大液体流量，加强湍流和加强搅拌。,40,2.3.4,冰冻干燥,冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一，因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。,冰冻干燥是先将生物大分子的水溶液冰冻，然后在低温和高真空下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的原理可用溶剂的三相点相图来说明，见图,6,：,41,42,当温度在三相点,O,以下，将压力降至,OC,线以下，溶剂（通常是水）就可以由固相直接升华为汽相。,冰：40 上方蒸汽压为0.1,mmHg，,60 上方的蒸汽压为0.01,mmHg。,1克0的冰变成0的蒸汽需吸热580千卡，容器外壁上会挂霜。,突出的优点：,样品不起泡，不暴沸。,得到的干粉样品不粘壁，易取出。,冰干后的样品是疏松的粉末，易溶于水。,43,样品溶液：,样品要溶于水，不含有机溶剂，否则冰点降低，样品易融化，起大量泡沫，使样品变性，污染真空泵油。,样品要予先脱盐，否则冰冻后易融化。,样品缓冲液在冰冻时,pH,可能会有较大变化需加入,pH,稳定剂，如糖类和钙离子等。,样品溶液的浓度不要过稀，例如蛋白质的浓度不低于15,mg/mL,为宜。,44,装样品溶液的容器：,用各种尺寸的培养皿盛样品溶液，液层不要太厚，可以使用安瓿并和青霉素小并。用烧杯时液层厚度不要超过2,cm,。,冻干稀溶液时会得到很轻的绒毛状固体样品，容易飞散而损失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水纸包住杯口，刺的孔不要过小过少，否则会影响冻干速度。,溶液冰冻：,可用干冰,乙醇低温浴速冻，边冻边旋转形成很薄的冰冻层，可以大大加快冻干的速度。,45,冻干：,样品全部冻干前，不要轻易摇动，以防水蒸汽冲散冻干的样品粉末。,若外霜消失，则说明样品已冻干，或是仅剩样品中心的小冰块，再稍加延长冻干时间即可。,冻干后要及时取出样品，以免样品在室温下仃留时间过长而失活。,仃真空泵时要先放气，以免泵油倒灌。放气时要缓慢，以免气流冲散样品干粉。,样品冻干后要及时密封冷藏，以防受潮。,真空泵要经常检查油面和油色，油面过低和油色发黑，则需换油。,46,2.3.5,样品的保存,生物大分子制成品的正确保存极为重要，一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有，损失惨重，全功尽弃。,影响生物大分子样品保存的主要因素有：,空气,：空气空气的影响主要是潮解、微生物污染和自动氧化。,温度,：每种生物大分子都有其稳定的温度范围，温度升高10，氧化反应约加快数倍，酶促反应增加13倍。,47,水份,：样品本身所带的水份和由空气中吸收的水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。加速氧化、聚合、离解和霉变。,光线,：某些生物大分子可以吸收一定波长的光，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的紫外线能量大，影响最大，样品受光催化的反应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因此样品通常都要避光保存。,样品的,pH,：,保存液态样品时注意其稳定的,pH,范围，正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类和浓度十分重要。,时间,：生化和分子生物学样品不可能永久存活，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存的样品必须写明日期，定期检查和处理。,48,现以保存蛋白质和酶为例：,低温下保存,：通常要保存于520，70保存最理想。极少数酶可以耐热：如核糖核酸酶可以短时煮沸；胰蛋白酶在稀,HCl,中可以耐受90；蔗糖酶在5060可以保持15,min 30 min,不失活。还有少数酶对低温敏感，如鸟肝丙酮酸羧化酶。,制成干粉或结晶保存,：蛋白质和酶固态比在溶液中要稳定的多。固态干粉制剂放在干燥剂中可长期保存。,49,在保护剂下保存,：,惰性的生化或有机物质：如糖类、脂肪酸、牛清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持稳定的疏水环境。,中性盐：有一些蛋白质要求在高离子强度（1,mol/L4mol/L,或饱和的盐溶液）的极性环境中才能保持活性。常用,MgSO,4、,NaCl、(NH,4,)SO4,等。使用时要脱盐。,巯基试剂：一些蛋白质和酶的表面或内部含有半胱氨酸巯基，易被空气中的氧缓馒氧化为磺酸或二硫化物而变性，保存时可加入半胱氨酸或巯基乙醇。,50,2.3.6,分离纯化方法的选择,制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：,以,分子大小和形态的差异,为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。,以,溶解度的差异,为依据的方法：盐析、萃取、分配层析、选择性沉淀和结晶等。,以,电荷差异,为依据的方法：电泳、电渗析、等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。,以,生物学功能专一性,为依据的方法：亲和层析等。,51,早期分离纯化,1)特点：,粗提取液中物质成份十分复杂。,欲制备的生物大分子浓度很稀。,物理化学性质相近的物质很多。,希望能除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质。,2)对所选方法的要求：,要快速、粗放。,能较大地缩小体积。,分辨力不必太高。,负荷能力要大。,52,3)可选用的方法：,吸附；,萃取；,沉淀法（热变性、盐析、有机溶剂沉淀等）；,离子交换（批量吸附、胖柱交换）；,亲和层析等。,53,晚期分离纯化,1)可选用的方法：,吸附层析、,盐析、,凝胶过滤、,离子交换层析、,亲和层析、,等电聚焦制备电泳、,制备,HPLC,等。,54,2)要注意的一些问题：,盐析后要及时脱盐。,用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/101/6，也可以使用串联柱以加大柱床体积。,必要时也可以重复使用同一种分离纯化方法，例如：分级有机溶剂沉淀、,分级盐析、,连续两次凝胶过滤、,离子交换层析等。,55,分离纯化步骤前后要有科学的安排和衔接，尽可能减少工序，提高效率。,例如吸附不可以放在盐析之后，以免大量盐离子影响吸附效率；离子交换要放在凝胶过滤之前，因为离子交换层析的上样量可以不受限制，只要不超过柱交换容量即可。,分离纯化后期，目的产物的纯度和浓度都大大提高，此时对于很多敏感的酶极易变性失活，因此操作步骤要连续、紧凑，尽可能在低温下（如在冷室中）进行。,得到最终产品后，必要时要立即冰冻干燥，分装并写明标签，20或70保存。,56,