实验六酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酵母蔗糖酶的粗提及其比活力测定,1,蔗糖酶活性及比活性测定原理,+,蔗糖酶,2,蔗糖酶的酶活单位：在,40,水浴反应,10min,，测定吸光值,A,540,，增加,0.01,个光吸收值的酶量为一个酶活力单位（,U,）。,蔗糖酶比活力测定：每毫克蔗糖酶蛋白所具有的活力单位，对同一种酶来说，酶的比活力越高，酶的纯度越高。,3,试剂,（一） 蔗糖酶的粗提及活性测定,（,1,）冰冻无水乙醇：,1,瓶,/,班,（,2,）,0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer,，,2000ml,（全班共用）,（,3,）,0.5mol/L,蔗糖,用,0.01 mol/L pH6.0 PBS buffer,配制，,200ml,（大组共用）,（,4,）,2 mol/L NaOH,，,1000ml,（全班共用）,（,5,）,3,5-,二硝基水扬酸,(DNS),试剂：可配,300ml,（全班共用）,19.2,克酒石酸钾钠溶于,50ml,水中（电炉加热溶解，不用沸腾），把,.0.63,克,3,5-,二硝基水杨酸,(DNS),和,26.2ml2 mol/L NaOH,加到酒石酸钾钠的热溶液中，电炉加热溶解，冷却到,50-60,，再加,0.5,克苯酚和,0.5,克亚硫酸钠搅拌使溶解冷却后加水定容至,100ml,，过滤，贮于棕色瓶中。,4,实验方法,（,一）粗提取酵母蔗糖酶,（,1,） 量取,2g,的面包酵母，加液氮研磨（加入少量石英砂）充分研磨，再加入,18ml,的,0.01mol/L PBS,（,pH 6.0,），,搅拌混合,再加入液氮研磨,（,2,）待溶液完全解冻后,转入离心管,2ml PBS,洗研钵,转入离心管,.,5,（二）热提取酵母蔗糖酶,（,3,）,11000r/min,离心,10min,，离心后取上清液，按下表方法分别测蔗糖酶,A,的活性及蛋白含量（蛋白含量略）。,（,4,） 将上述上清液置于,45,的恒温水浴锅中，用玻璃棒缓慢搅拌,30min,，然后置于冰浴中迅速冷却,5min,。然后装入离心管中，离心，转速,11000r/min,条件下离心,10min,，离心后取上清液，按下表方法分别测蔗糖酶,B,的活性及蛋白含量。,6,（三）乙醇提取酵母蔗糖酶,（,1,）取上述第,4,步中的上清液,10ml,，缓慢加入,10ml,的冰冻的无水乙醇（乙醇的终浓度为,50,），并搅拌,5min,，此过程在冰浴中进行。然后装入离心管中，转速,3000r/min,条件下离心,5min,，离心后弃上清液，留沉淀，离心管倒置于滤纸上，尽可能去除乙醇残液。,（,2,）将沉淀用,15ml,的,0.01mol/L,的,PBS,（,pH6.0,）搅拌溶解,30min,，溶液如为浑浊液，,10000r/min,离心,10min,，离心后取上清液，按下表方法测蔗糖酶,C,的活性及蛋白含量。,7,表,1,酵母蔗糖酶酶活性及比活力测定,8,实验结果分析,思考题：,（,1,）比较哪种蔗糖酶的粗提方法使酶的活性及纯度较高。,（,2,）本实验中有哪些影响蔗糖酶活性的因素。,9,