原位杂交组织化学课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,原位杂交组织化学,（,in situ hybridization histochemistry,）,原位杂交组织化学 （in situ hybridizat,一、原位核酸分子杂交（,ISHH,）技术的,基本原理,是应用已知碱基顺序并带有标记物的,核酸探针,与组织、细胞中,待测的核酸,按碱基配对的原则进行特异性结合以形成,杂交体,，再应用与标记物相应的,检测系统,，通过免疫组织化学方法在被检测的核酸,原位形成一定带颜色的杂交信号。,突出优点：可以在原位精确测定含有靶核苷酸序列的细胞类型及分布,有形态学上的意义。,一、原位核酸分子杂交（ISHH）技术的基本原理是应用已知碱,二、探针,1,、概念,探针,(Probe):,是含有,互补顺序,的,外源性,被,标记,的,DNA,或,RNA,片段,。是在原位杂交中用于检测细胞内特定,DNA,或,RNA,顺序定位的特殊试剂。探针的碱基序列是已知的，只能与特定的核酸分子结合。,2,、常用探针种类：,DNA,探针,:,ssDNA,、,dsDNA,）、,cDNA,探针,RNA,探针：,同义,RNA,探针、反义,RNA,探针（,cRNA,）。,RNA,探针是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应极高。,寡核苷酸探针：,DNA,合成仪依杂交的靶核苷酸序列合成。,探针分子一般,20-50bp,。,二、探针,3,、探针标记的种类：,放射性标记,-,标记物为放射性同位素，如,3,H,、,35,S,、,32,P,。,敏感性高，特异性强，但对人体有伤害。,非放射性标记,-,多采用生物素（内源性生物素的存在限,了其应用）、 地高辛（,Dig,）、荧光素、酶等标记,。,地高辛标记物,洋地黄毒苷,(Dig),，不会产生内源性相似物质的干扰，敏感性与放射性核素标记的探针相仿。杂交的切片背景好、细胞定位准确，是,当前杂交化学最为流行的方法。,3、探针标记的种类：地高辛标记物,三、原位杂交组织化学方法,1,、原位杂交的类型：,根据探针标记物是否能被直接检测到，分为直接法和间接法。,直接法,:,标记物为放射性同位素、酶或荧光。,间接法,:,标记物为半抗原，如生物素或地高辛。,2,、原位杂交技术基本方法,杂交前准备：标本制备、探针制备,杂交：,杂交后处理：,显示：,三、原位杂交组织化学方法,1,、固定,保持细胞形态结构；,最大限度的保存细胞内的,DNA,或,RNA,的水平；,使探针易于进入组织或细胞。,对于,DNA,来说，固定剂的种类和浓度并不十分重要。,RNA,非常容易降解,，固定剂 的种类、浓度、固定时间非常重要。而且取材后应尽快冷冻或固定。在解释,ISHH,的结果是应考虑到取材至冷冻或进入固定剂这段时间对,RNA,保存多带来的影响。,杂交前准备,1、固定 杂交前准备,固定剂：,最常用多聚甲醛（不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透细胞或组织），被公认为,ISHH,较为理想的固定剂。,对于,mRNA,的定位，,常采用的方法是：,组织也可在取材后直接置于液氮冷冻，切片后将其浸入,4%,多聚甲醛约,10,分钟，空气干燥后保存在,-70,可保存数月之久。,将组织固定于,4%,的多聚甲醛磷酸缓冲液中,1-2h,，在冷冻前浸入,15%,蔗糖溶液中，置,4,冰箱过夜，次日切片或保存在液氮中。,固定剂：最常用多聚甲醛（不会与蛋白质产生广泛的交叉连接，不会,2,、玻片处理 包括载玻片和盖片,热肥皂水,刷洗，,自来水,清洗干净后，置于,清洁液,中浸泡,24,小时，,清水,洗净烘干，,95%,酒精中浸泡,24h,后蒸馏水冲洗，烘干。烘箱温度最好在,150,或以上过夜以去除任何,RNA,酶。盖玻片最好硅化处理，锡箔纸包裹无尘保存。,粘片剂： 多聚赖氨酸液、,APES,。最后用,DEPC,处理的蒸馏水清洗玻片,1-2,次。,2、玻片处理 包括载玻片和盖片,3,、增强组织通透性,稀释的酸洗涤，去垢剂，清洗剂,TritonX-100,，某些消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶等）,注意：,在增强组织通透性的同时，也会降低,RNA,的保存量和影响组织结构的形态。因此用量和孵育时间上应谨慎掌握。此步骤根据应用固定剂的种类、组织的种类、切片的厚度和核酸探针的长度而定。,3、增强组织通透性,4,、防止,RNA,酶的污染,在整个操作过程中应戴手套和口罩；,玻璃器皿常规洗净后，应用,RNA,酶抑制剂（,0.1%,的二乙基焦磷酸盐液，,DEPC,）浸泡处理（,37,2h,）,再用双蒸灭菌水漂洗几次，高压消毒去除,DEPC,然后于,180 ,烘烤,4h.;,镊子高温烘烤。,塑料器皿最好用一次性用品，使用前进行高压消毒；,所有溶液应加,DEPC,，终浓度为,0.05-0.1%,，室温处理过夜。然后高压处理以去除所有残留的,DEPC.,4、防止RNA酶的污染,就是将杂交液滴加于要检测的组织或细胞上，加盖硅化的盖玻片，为了防止杂交液的蒸发，可在盖玻片的周围用,橡皮泥封固,（清洁）或液体石蜡（易污染），时间为,12-20,小时，温度为,37-52.,如果探针为双链,DNA,探针，杂交前应有变性这一过程。,方法,:,分开变性（杂交前热变性）,共同变性（加到切片上封固后再变性。应用原位,PCR,仪或原位杂交仪）,杂 交,预 杂 交,目的,:,饱和组织中可能与核苷酸探针分子结合的非特异性位点，以降低本底，提高信噪比。预杂交液新鲜配制。,就是将杂交液滴加于要检测的组织或细胞上，加盖硅化的盖玻片，为,目的：,去除过剩探针，减少非特异性信号。,方法：采用高盐浓度漂洗，减少探针与组织静电结合。,杂交后处理包括系列不同浓度，不同温度的盐溶液的漂洗。洗涤的条件如盐溶液的浓度、温度、洗涤次数和时间因核酸探针的类型和标记的种类不同而略有差异，,一般遵循的共同原则,是盐溶液浓度由高到低而温度由低到高。如何控制漂洗的严格度从而达到理想的信,/,噪比必须从反复的实践中取得经验。,注意：,漂洗过程中切勿使切片干燥；防止切片脱落。,杂交后处理,目的：去除过剩探针，减少非特异性信号。杂交后处理,显示（杂交体的检测）,又可称为检测系统（,Detection system,）,同位素标记,:,采用放射自显影检测,生物素标记：采用,ABC,、,SP,等免疫组化方法检测,地高辛标记：采用,anti-Dig-HRP-DAB,检测系统,荧光标记,:,荧光显微镜观察,酶标记：底物直接显色。,显 示,显示（杂交体的检测）显 示,四、影响原位杂交的因素,四、影响原位杂交的因素,1,、探针的浓度,最佳原则是应用最低探针浓度以达到与靶核苷酸的最大饱和结合度为目的。一般在原位杂交细胞化学中，探针浓度为,0.5,5.0g/ml,（即,0.5,5.0ng/l,）。,加杂交液的量要适当，以,10,20l/,每张切片为宜。过多不仅造成浪费，而且液量常易致盖玻片滑动脱落；过量的杂交液含核酸探针浓度过高，反易导致高背景染色。,2,探针的长度,应用于,ISHH,探针的最佳长度应在,50,100,个碱基之间。探针短易进入细胞，杂交率高，杂交时间短。,1、探针的浓度,3,杂交的温度和时间,原位杂交中，多数,DNA,探针需要的,Tm,是,90,，而,RNA,则需要,95,。这种高温对保存组织形态完整和保持组织切片粘附在载玻片上是不可能的。因此，在杂交的程序中常规的加入,30%,50%,甲酰胺,于杂交液中。反应液中每增加,1%,的甲酰胺浓度，,Tm,值可降低,0.72,。由于盐和甲酰胺浓度的调节等因素，实际采用的原位杂交的温度在,Tm-25,左右，大约,在,30,60,之间。,杂交的时间如过短会造成杂交不完全，而过长则会增加非特异性染色。从理论上讲，核苷酸杂交的有效反应时间在,3h,左右。为稳妥起见，一般将,杂交反应时间定为,16,20h,，或为简便起见杂交孵育过夜。,原位杂交组织化学课件,4,杂交严格度（,Hybridization stringency,）,杂交条件的严格度表示通过杂交及冲洗条件的选择对完全配对及不完全配对杂交体的鉴别程度。,错配对杂交体稳定性较完全配对杂交体差。通过控制杂交温度、盐浓度等，可减弱非特异性杂交体的形成，提高杂交的特异性。,杂交的条件愈高，特异性愈强，但敏感性降低。,低严格度杂交,及冲洗条件在,Tm -35,至,Tm,40,之间，高盐或低甲酰胺浓度。在这种条件下，大约有,70%,90%,的同源性核苷酸序列被结合，其结果是导致非特异性杂交信号的产生。,中严格度，,Tm -20,至,Tm-30,的范围。,高严格度,为,Tm-10,至,Tm-15,，低盐和高甲酰胺浓度。在这种条件下，只有具有高同源性的核苷酸序列才能形成稳定的结合。,4杂交严格度（Hybridization stringe,5,硫酸葡聚糖和甲酰胺,硫酸葡聚糖是核酸杂交液中仅次于甲酰胺的一种组成成份。在杂交液中，甲酰胺占,50%,左右，而硫酸葡聚糖占,10%,左右。它是一种大分子的多聚胺化合物，具有极强的水合作用，因而能大大增加杂交液的粘稠度，其主要作用是促进杂交率，特别是对双链核酸探针。,甲酰胺的主要作用在于调节杂交反应温度方面，从而有助于保持组织的形态结构。,5硫酸葡聚糖和甲酰胺,免疫组织化学课程作业,1,、常用免疫组织化学方法有哪些？,2,、简述酶免疫组织化学的基本原理。,3,、简述单克隆抗体制备的基本原理。,4,、简述免疫血清的制备过程。,5,、简述核酸分子原位杂交组织化学的过程。,6,、增强免疫组织化学技术敏感性的方法有哪些？,7,、请列出几种能分别与,DNA,和蛋白质结合的荧光素。,任选四道题回答。,免疫组织化学课程作业,