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#,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,二、 转录水平的调控,1.,转录调控的原理,2.,原核生物转录调控的操纵子学说,3.,乳糖操纵子与负控诱导系统,4.,色氨酸操纵子与负控阻遏系统,5.,其他操纵子,6.,转录水平上的其他调控方式,4,.,色氨酸操纵子,(,trp,operon),trp,体系参与生物合成，它不受葡萄糖或,cAMP-CRP,的调控。,色氨酸合成主要分,5,步完成，有,7,个基因参与整个合成过程。,操纵子中各基因功能：,trpE,和,trpG,编码邻氨基苯甲酸合酶，,trpD,编码邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶，,trpF,编码异构酶，,trpC,编码吲哚甘油磷酸合酶，,trpA,和,trpB,则分别编码色氨酸合酶的,和,亚基。,在许多细菌中，,trpE,和,trpG,，,trpA,和,trpB,分别融合成一个基因，产生具有双重功能的蛋白质。,分,支,酸先在邻氨基苯甲酸合成酶作用下生成邻氨基苯甲酸,，此后先与磷酸核糖焦磷酸中的磷酸核糖形成磷酸核糖邻氨基苯甲酸，经重排、脱羧和关环形成吲哚甘油磷酸，然后在色氨酸合成酶催化下先脱去,3-,磷酸甘油醛生成吲哚，最后吲哚与一个丝氨酸缩合形成色氨酸。,E.Coli,中,trp,操纵子的结构,5,个色氨酸合成代谢相关酶的基因构成一个操纵子。,合成,Trp,所需要酶类的,5,个基因,E,、,D,、,C,、,B,、,A,头尾相接串连排列组成结构基因群；受其上游的启动子,P,和操纵子,O,的调控。,这些基因只有在缺乏,Trp,时，才被有效表达。,trp,操纵子,基因产物是,5,个酶，分别是邻氨基苯甲酸合成酶,(E),、邻氨基苯甲酸磷酸核糖转移酶,(D),、磷酸核糖邻氨基苯甲酸异构酶,-,吲哚甘油磷酸合成酶,(C),、 色氨酸合成酶, (B),和色氨酸合成酶 (A)。,色氨酸操纵元的调控机制,trp,操纵元,属,阻遏型操纵元,，主要调控一系列用于色氨酸合成代谢的酶蛋白的转录合成。,色氨酸操纵子,通常处于开放状态,，其辅阻遏蛋白不能与操纵基因结合而阻遏转录。而当色氨酸合成过多时，色氨酸作为辅阻遏物与辅阻遏蛋白结合而形成阻遏蛋白，后者与操纵基因结合而使基因转录关闭。,4.1,辅阻遏蛋白的负调控,与,lac,操纵子的调控不同的是，,控制,trp,操纵子的阻遏蛋白的效应物（,Trp,）不是一个诱导物（,inducer,）,而是一个,辅阻遏物（,corepressor,）。,也就是说，,trp,操纵子的调节基因的产物（阻遏物蛋白）无活性，不能与操纵基因结合；当,Trp,存在时，它与阻遏物蛋白结合，诱导该蛋白构象变化，能够结合在操纵基因上并阻止转录。,调控基因,trpR,的位置远离,P-O-,结构基因群，,在其自身的启动子作用下，以组成型方式低水平表达调控蛋白,R,，,R,并无活性,。,当提供足够的,Trp,时，,Trp,与,R,结合使其构象改变而成为活性形式,R,，,R,可与操纵基因,O,特异性结合，阻遏结构基因的转录，,R,的阻遏能力仅为,lac I,产物的,1/1000,。,trp,操纵子中产生阻遏物的基因是,trpR,，该基因距,trp,基因簇很远。后者位于大肠杆菌染色体图上,25,分钟处，而前者则位于,9,5,分钟处,。在位于,65,分钟处还有一个,trpS,（色氨酸,tRNA,合成酶），它与携带有色氨酸的,tRNA,Trp,共同参与,trp,操纵子的调控作用。,大肠杆菌基因组定位是根据在接合过程中染色体转移时间确定的。在接合过程中大肠杆菌基因组全部转移需要100分钟，不同的基因位点位于不同的 时间点上。,trpR,trpS,(,色氨酰,tRNA,合成酶,),trpa,当有足够的,Trp,时，操纵子自动关闭。细菌直接利用外界的,Trp,。,缺乏,Trp,时，,trp,操纵子被打开，,5,个结构基因表达，产生,3,个酶催化分支酸合成为,Trp,。,这是一种负性调控，操纵子通常是开放转录的。,当有效应物,(Trp),作用时，诱导使阻遏蛋白,R,构象发生变化，能够结合于操纵基因，则阻遏转录,。,4.2,色氨酸操纵子的衰减调控,研究表明色氨酸操纵子存在,两种,机制的调控。如果,trp,操纵子只受,trpR,编码的阻遏物调控，那么在缺乏或存在色氨酸时，,trpR,突变使,trp,操纵子表达的酶量应该是相同的。可是，在,trpR,缺失突变体中，培养基中缺乏色氨酸比有色氨酸存在时操纵子的表达水平更高，说明色氨酸操纵子除受阻遏物调控外，还受另一机制的调控。,4.2.1 弱化子与前导肽,当阻遏物对,trp,操纵子的阻遏作用被解除，但细胞内仍有一定浓度的色氨酸时，第二种调控机制使,trp,操纵子的转录在抵达,trpE,之前被提前终止，这种现象称为,弱化作用,（,attenuation,），,DNA,中导致,mRNA,合成提前终止的一段序列称为弱化子（,attenuator,）。,弱化作用产生的关键在于,trp,mRNA,的前导区。,在,trp,操纵子pTrp-O与,trpE,间有一段162bp的先导序列(leading sequence, L)。在L内有一段123150bp的序列，它在转录起始后可调控转录过程的进行。,这段碱基序列如果缺失，,trp,基因表达可提高6-10倍。mRNA合成起始以后，除非培养基中完全没有色氨酸，转录总是在这个区域终止，产生一个仅有140个核苷酸的RNA分子，终止,trp,基因转录。这个区域被称为,弱化子,，该区mRNA可通过自我配对形成茎-环结构。,弱化子的共同特点是,某些外部因素控制着弱化子的发夹形成,，即形成终止子结构。,弱化子为结构基因的转录设了一道关卡。,前导肽,分析前导序列发现，它包括起始密码子,AUG,和终止密码子,UGA,，能产生一个含有,14,个氨基酸的多肽，这个假设的多肽被称为前导肽。,在前导序列的第,10,和第,11,位上有,相邻的两个色氨酸密码子,。组氨酸操纵子含有,7,个相邻的组氨酸密码子，苯丙氨酸操纵子也有,7,个苯丙氨酸密码子，这些密码子参与了操纵子中的转录弱化机制。,先导序列包括起始密码子,AUG,和终止密码子,UGA,，它编码了一个,14,个,AA,的先导肽。编码先导肽的第,10,、,11,位是相邻的两个,Trp,密码子。,先导序列含有,3,对反向重复序列,(A=1+2,；,B=2+3,；,C=3+4),。,如果,B(2+3),形成发夹结构，,A,和,C,都不能再形成发夹结构。,A,C,当,A,（,1+2,）形成发夹结构时，,B,就不能形成发夹结构，却有利于,C,（,3+4,）生成发夹结构。,B,C,后是,poly(U),，即,C,实际是一个终止子，如果转录,mRNA,时它形成发夹结构，就能使,RNA,聚合酶停止转录而从,mRNA,上脱离下来。,mRNA,前导区的序列分析,trp,前导区的碱基序列已经全部测定，引人注目的是其中,4,个分别以,1,、,2,、,3,和,4,表示的片段能以两种不同的方式进行碱基配对，有时以,1-2,和,3-4,配对，有时只以,2-3,方式互补配对。,终止构型,抗终止构型,无色氨酸时操纵子基因开始转录，此后转录速率受转录,弱化机制,(attenuation)调节。在,结构基因,与,O,之间有一衰减子区域 ，该区域含有4段特殊的序列，高浓度色氨酸时能形成不依赖因子的转录终止信号，RNA聚合酶脱落，转录终止。低浓度色氨酸时则不能形成转录终止信号，转录继续。,4.2.2,弱化子的负调控,原核生物转录和翻译几乎同时进行，在,Trp,未达到能起阻遏作用的浓度时，从,P,trp,起始转录，,RNA,聚合酶沿,DNA,转录合成,mRNA,，同时核糖体结合在,mRNA,上开始翻译。,当,Trp,水平高时，已经起始了转录的,RNA,聚合酶在特定的位点暂停，接着在到达,trp E,之前终止。,但当,Trp,缺乏时，聚合酶不终止，而是通读,trp,基因。,Trp,合成酶类的量与,Trp,浓度呈负相关，这种调控现象与,Trp,操纵子特殊的结构有关。,Trp,浓度低时，生成,Trp-tRNA,trp,量少，使核糖体停止在,mRNA,上的,Trp,密码子,UGG,处；使,A,（,1,与,2,）不能形成发夹结构；而,2+3,形成发夹结构，阻止了,3+4,生成终止子；,RNA pol,可沿,DNA,继续转录，,trp,操纵子就处于开放状态。,Trp,浓度高时，,trp-tRNA,trp,浓度随之升高，核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸密码子，在,4,区被转录之前就到达,2,区，使,2+3,不能配对，而,3+4,区可以自由配对形成茎,-,环状终止子结构，转录停止，结构基因被关闭而不再合成色氨酸。,Trp,的存在对终止转录是有效的，弱化子仅允许约,10%,的,RNA,聚合酶通过。,缺乏,Trp,时，弱化子允许所有的聚合酶通过。,当所有的氨基酸都不足时，核糖体翻译移动的速度就更慢，甚至不能占据,A,的序列，结果有利于,1+2,和,3+4,发夹结构的形成，于是,RNA pol,停止转录。,色氨酸操纵子代表了一种衰减调控模式,在,trp,操纵子上，,弱化子的转录终止作用取决于色氨酸的浓度。,a. 高色氨酸条件下，序列3和4配对，形成转录终止发夹。b. 低色氨酸条件下，核糖体停在色氨酸密码子附近，序列1被核糖体覆盖，序列2和3配对，因此阻止了3、4之间形成转录终止发夹。c 没有蛋白合成时，如果没有核糖体起始先导肽的翻译，序列1、2形成发夹，阻止了2、3发夹的形成，允许序列3、4形成转录终止发夹，酶不表达。,实验证据,转录弱化理论得到了大量实验证据的支持：（1）影响区段3和区段4二级结构稳定性的突变以及改变区段4后面一串U的突变都会降低弱化子的终止作用，增加,trp,操纵子的表达，这与终止子的突变效应是一样的；（2）相反，影响区段2和3配对的突变，则增加弱化子的弱化作用；（3）如果前导肽的起始密码子发生错义突变，前导肽的翻译就不能起始，有利于前导RNA形成12、34二级结构，则转录必定在弱化子处终止。,有实验证明，在不加色氨酸的培养基中，,trp,mRNA的合成仍然受到部分阻遏，现在一般认为，野生型细胞中同时存在着有活性和无活性的阻遏物，培养基中色氨酸浓度的变化，能够使这两种阻遏物间的平衡发生倾斜，最终做出关闭或启动,trp,操纵子的决定，从而维持一定的色氨酸含量。,4.2.3,阻遏与弱化作用的协调,细菌中为什么需要弱化子系统呢？,一种可能是阻遏物从有活性向无活性的转变速度较慢，需要一个能更快地做出反应的系统，以保持培养基中适当的色氨酸水平。或者，弱化子系统主要是对外源色氨酸浓度做出反应。外源色氨酸浓度很低的信号虽然足以引起,trp,操纵子的去阻遏作用，但是这个信号还不足以很快引发内源色氨酸的合成。在这种环境下，弱化子就通过抗终止的方法来增加,trp,基因表达，从而提高内源色氨酸浓度。,那么为什么还要有阻遏体系呢？,没有阻遏体系,，只有弱化，似乎也可以调节色氨酸酶系的合成。目前认为阻遏物的作用是当有大量外源色氨酸存在时，阻止非必需的先导,mRNA,的合成，,它使这个合成系统更加经济,。,事实上,，自然界存在着不同类型的合成体系，例如组氨酸操纵子拥有在功能上与,trp,操纵子完全相同的弱化子结构，但没有阻遏物，它的表达完全受弱化子调节。,在,trp,操纵子中，阻遏蛋白的负调控起到粗调的作用，而衰减子起到细调的作用。,细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，而对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停顿下来。,阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少，弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少，通过前导肽的翻译来控制转录的进行。,细菌细胞内这两种作用相辅相成,，体现着生物体内周密的调控作用。,5.1,半乳糖操纵子,(galactose operon),Galactose operon包括3个结构基因（,gal,E、,gal,T、,gal,K）表达产生的异构酶(UDP-galactose-4-epimerase)、半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galactose transferase)和半乳糖激酶(galactose kinase)参与Gal代谢，形成UDPGal，用于合成细胞壁。,5.1.1,半乳糖操纵子的结构及特点,激酶,K,UDP,转移酶,T,差向异构酶,E,半乳糖,半乳糖,+,葡萄糖,半乳糖,-1-,磷酸,乳糖,UDP-,葡萄糖,UDP-,半乳糖,+,G-1-P,葡萄糖,UDP,转移酶,T,细胞壁,当细胞中缺乏葡萄糖时，这些酶可使,Gal,转变成,G-1-P,，供细菌生命活动需要。,gal,操纵子属于,诱导型,操纵子。调节基因,gal,R,距离结构基因,gal,E,、,T,、,K,及操纵区,O,等很远，而,galR,产物对,galO,的作用与,lacI-lacO,的作用相同。,Gal,是,gal,操纵子的诱导物。,Gal,的跨膜运输需要,galP,基因产物,的参与。,gal,操纵子的特点：,它有两个启动子，每个启动子拥有各自的,RNA,聚合酶结合位点,S1,和,S2,。其,mRNA,可从两个不同的起始点开始转录；,有两个,O,区，一个在,P,区上游,-67,53,（,OE,），一个在结构基因,galE,内部（,OI,）。, cAMP-CAP,位点在,-24-50,之间。,gal,操纵子有两个相互重叠的启动子，可从两个不同的起始点（,S,1,、,S,2,）开始转录；,gal P,1,的转录起始依赖于,CRP,，属于,CRP,激活型，因此,只有培养基中无葡萄糖时才能进行转录，,RNA,聚合酶与,S1,的结合需要半乳糖和,CRP,。,高水平的,CRP,能抑制,gal P,2,的转录起始，属于,CRP,抑制型。因此它完全依赖于葡萄糖。,即,:,当有,CRP,时，转录从,S,1,开始，当无,CRP,时，转录从,S,2,开始。,cAMP-CRP,有利于,RNA,聚合酶,-S1,区复合物形成开链构象，从而起始基因转录。同时，由于,S,2,在,S,1,的上游且核苷酸部分重叠，,S,2,与,CAP,位点靠近，在空间位置上这一复合物的存在干扰了,RNA,聚合酶,-S2,复合物的形成，抑制了,S,2,起始的转录。,葡萄糖存在时,若无,Gal,，,Gal R,可结合在,gal O,E,和,O,I,上，并相互作用形成环，从,S,1,、,S,2,的转录都被阻遏。,当,Gal,存在时，,Gal R,的阻遏解除，但由于葡萄糖的存在，,P,1,不能启动而只有,P,2,低水平启动转录。,无葡萄糖存在,:,若存在,Gal,，,gal,的阻遏解除，依赖于,CRP,的,P,1,高水平表达产生利用,Gal,的酶类，以,Gal,为能源和碳源。,5.1.2,双启动子的实验证据,一类细菌突变株能在无葡萄糖的培养基中高水平合成半乳糖代谢酶类（,gal,结构基因高效表达，由,gal P,1,起始转录）；,另一类突变株中,gal,基因的表达完全依赖于葡萄糖，培养基中如无葡萄糖存在，这些细菌的,gal,基因不表达，不合成半乳糖代谢酶类（由,gal P,2,起始转录）。,5.1.3,gal,操纵子双转录起点的作用,半乳糖不仅可以作为唯一碳源供细胞生长，而且与之相关的,UDPGal,是,E. coli,细胞壁合成的前体。,在无外源,Gal,时，,UDPGal,是通过半乳糖差向异构酶（,gal,E,基因的产物）的作用由,UDP-,葡萄糖合成的。,因此细胞必须一直能够合成差向异构酶才能正常生活。,现在设想只有,galP1,一个启动子，那么由于这个启动子的活性依赖于,cAMP-CRP,，当培养基中有葡萄糖存在时就不能合成异构酶。假如唯一的启动子是,galP2,，那么，即使在葡萄糖存在的情况下，半乳糖也将使操纵子处于充分诱导状态，这无疑是一种浪费。无论从,必要性,或,经济性,考虑，都需要一个不依赖于,cAMP-CAP,的启动子（,galP2,）进行本底水平的永久型合成，以及一个依赖于,cAMP-CRP,的启动子（,galP1,),对高水平合成进行调节。,5.2.1,阿拉伯糖操纵子的结构及特点,阿拉伯糖是另一个可以为代谢提供碳源的五碳糖。在大肠杆菌中阿拉伯糖的降解需要,3,个基因：,araB,、,araA,和,araD,，分别编码,3,个酶：,araB,基因编码核酮糖激酶,(ribulokinase),，,araA,编码,L-,阿拉伯糖异构酶,(L-arabinose isomerase),，,araD,编码,L-,核酮糖,-5-,磷酸,-4-,差向异构酶,(L-ribulose-5phosphate-4-epimerase),。另外还有两个远离此基因簇的基因,araE,和,araF,，负责将阿拉伯糖运入细胞。,5.2,阿拉伯糖操纵子,(arabinose operon),与,araBAD,相邻的是一个复合的启动子区域、两个操纵区和一个调节基因,araC,，这个,AraC,蛋白同时显示正、负调节因子的功能。,araBAD,和,araC,基因的转录是分别在两条链上以相反的方向进行的。,5.2.2 AraC,蛋白的正、负调节作用,araBAD,mRNA,的合成需要一个有功能的,AraC,蛋白，这个蛋白与诱导物阿拉伯糖结合后才诱导,araBAD,基因表达。,当,AraC,蛋白以正调控因子作用时，起始转录还需要,cAMP-CRP,的共同参与。,AraC,蛋白作为,P,BAD,活性正、负调节因子的双重功能是通过该蛋白的两种,异构体,来实现的。,Pr,是起阻遏作用的形式，可以与现在尚未鉴定的类操纵区位点相结合，而,Pi,是起诱导作用的形式，它通过与,P,BAD,启动子结合进行调节。,在没有阿拉伯糖时，,Pr,形式占优势；一旦有阿拉伯糖存在，它就能够与,AraC,蛋白结合，使平衡趋向于,Pi,形式。这样，阿拉伯糖的诱导作用就可以解释为阿拉伯糖与,Pr,的结合，使,Pr,离开它的结合位点，然后，产生大量的,Pi,，并与启动子结合。,5.2.3,葡萄糖与阿拉伯糖对,ara,操纵子活性的影响,培养基中含有葡萄糖，没有阿拉伯糖,。因为培养基中含有葡萄糖，所以,cAMP-CAP,没有与操纵区位点相结合，,AraC,蛋白处于,Pr,形式并与,A,位点,(,araC,基因的操纵区,O1),结合，,RNA,聚合酶很少再与,Pc,结合，,araC,基因虽然仍有转录，但受到抑制，,只有少量,AraC,蛋白形成，整个系统几乎处于静止状态,。,没有葡萄糖，也没有阿拉伯糖,，因为没有诱导物，尽管有,cAMP-CAP,与操纵区位点相结合，,AraC,蛋白仍以,Pr,形式为主，无法与操纵区,B,位点,(,araI,诱导因子结合区）相结合，,无,araBAD,mRNA,转录。,无葡萄糖，有阿拉伯糖时,，大量,araC,基因产物以,Pi,形式存在，并分别与操纵区,B,、,A,位点相结合，在,cAMP-CAP,的共同作用下，,araC,和,araBAD,基因大量表达，操纵子充分激活。,5.3 阻遏蛋白LexA的降解与细菌中的SOS应答,参与,SOS DNA,修复系统的许多基因同时受,LexA,阻遏蛋白的抑制，平时表达水平很低。,recA,基因表达并不完全被阻遏，每个细胞中可有,1000,个蛋白单体分散在细胞质中。,DNA,严重受损时，,RecA,与缺口处单链,DNA,结合，被激活成蛋白酶，将,LexA,切割成没有阻遏活性的两个片段，导致,SOS,体系高效表达，,DNA,得到修复。,5.4 二组分调控系统的信号转导,在较多的情况下，外部信号并不直接传递给调节蛋白，而是首先通过传感器接收信号，然后以不同方式传到调节部位，这个过程就是信号转导,(signal transduction),。,目前已知最简单的细胞信号调节系统称为二组分系统，由两种不同的蛋白组成：,传感蛋白（,sensor protein,),应答调节蛋白,(response regulator protein),5.5 多启动子调控的操纵子,rRNA,操纵子 （,2,个启动子）,核糖体蛋白,SI,操纵子 （,4,个启动子）,DnaQ,蛋白操纵子 （,2,个启动子）,操纵子中有不同的启动子，他们有不同的强度，启动作用又受不同因子的调控。许多因素相互作用，才使基因表达更有效，更协调。在不同的生活环境中，不同的启动子精密地调节基因的表达量，对维持细菌的生存起着非常重要的作用。,
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