原位杂交技术原理及其应用教学课件_002

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,原位杂交技术,in situ hybridization,原位杂交技术原理及其应用.原位杂交技术,in situ hybridization,核酸分子杂交技术,心在研究DNA分子复制原理的基础上发展起,来的一种技术。两条核苷酸单链片段,通,过氢键结合,形成DNA_DNA、 DNA-RNA或,RNA-RNA双链分子,心按其作用方式可大致分为两种:固相杂交,和液相杂交,今液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游,离在溶液中。液相分子杂交技术包括吸附,杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复,性速率液相分子杂交等,心固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在,固体的支持物上(常用的有硝酸纤维素滤膜,其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等),另,一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相,杂交包括:,菌落原位杂交( co l ony in situ hybr idizat ion)、,今斑点杂交( Dot blot)、,心 Southern印迹杂交( Southern blot,今 Northern印迹杂交( Northern blot),心组织原位杂交( Tissue in situ hybr idizat ion,即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学,技术,核酸分子杂交技术,心在研究DNA分子复制原理的基础上发展起,来的一种技术。两条核苷酸单链片段,通,过氢键结合,形成DNA_DNA、 DNA-RNA或,RNA-RNA双链分子,心按其作用方式可大致分为两种:固相杂交,和液相杂交,今液相杂交是指参加反应的两条核酸链都游,离在溶液中。液相分子杂交技术包括吸附,杂交、发光液相杂交、液相夹心杂交和复,性速率液相分子杂交等,心固相杂交是将参加反应的一条核酸链固定在,固体的支持物上(常用的有硝酸纤维素滤膜,其它如尼龙膜、乳胶颗粒和微孔板等),另,一条参加反应的核酸链游离在溶液中。固相,杂交包括:,菌落原位杂交( co l ony in situ hybr idizat ion)、,今斑点杂交( Dot blot)、,心 Southern印迹杂交( Southern blot,今 Northern印迹杂交( Northern blot),心组织原位杂交( Tissue in situ hybr idizat ion,即原位杂交组织化学技术和原位杂交免疫细胞化学,技术,原位杂交技术的基本原理,利用核酸分子单链之间有互补的碱基顺序,通过,碱基对之间非共价键的形成,出现稳定的双链区,形成杂交的双链,1.两条核苷酸单链片段,在适宜的条件下,通过氢键,结合,形成 DNA-DNA、 DNA-RNA或 RNA-RNA双键分,子,2.应用带有标记的(有放射性同位素,如3H、35S,32P,荧光素、生物素、地高辛等非放射性物,质)DNA或RNA片段作为核酸探针,与组织切片或细,胞内待测核酸(RNA或DNA)片段进行杂交,3.用放射自显影等方法予以显示,在光镜或电镜下观,察目的mRNA或DNA的存在与定位,ICgA,TCG C-DNA,Vector,Transcription SP6 T7 T3 polymerase,Dige*ingain,Biotin,PAP,AIGCUAIGC GRNA,UCGAluc G m-RNA,用原位杂交术,可在原位研究细胞合成,某种多肽或蛋白质的基因表达。,此方法有很高的敏感性和特异性,可进,一步从分子水来探讨细胞的功能表达及,其调节机制。已成为当今细胞生物学,分子生物学研究的重要手段,In situ hybridization,Aromas gene,The rat brain section,培养细胞,原位杂交组织化学技术发展,1961年,Hal液相核酸杂交技术,1969年,Gal和 IPardue用爪蟾核糖体基因探针,与其卵母细胞杂交,确定该基因定位于卵母细胞,的核仁中。,1969年, Buongiorno- Narde l|i和Ama| d i john利,用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因,定位,创造了原位杂交细胞或组织化学技术。,0rth(1970)应用H标记的兔乳头状瘤病毒cRNA,探针与兔乳头状瘤组织的冰冻切片进行杂交,首,次用原位杂交检测了病毒DNA在细胞中的定位,但,当时的工作多采用冰冻组织切片或培养细胞,探,针均采用同位素标记。,由于同位素标记探针具有放射性既污染环境,又对人体有害,且受半衰期限制等缺点,科学,工作者们开始探索用非放射性的标记物标记核,酸探针进行原位杂交。, Bauman(1981)等首先应用荧光素标记cRNA探,针做原位杂交,然后用荧光显微镜观察获得成,功。,Shroyer(1982)报道用2,4二硝基苯甲醛,(DNP)标记DNA探针,使该DNA探针具有抗原,性,然后用兔抗DNP的抗体来识别杂交后的探,针,最后经免疫过氧化物酶的方法来定位杂交,探针。,这两种方法至今仍有采用,但因敏感度不够高,应用不够普遍。,