外源基因的表达和转基因生物的鉴定课件

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第八章 外源基因的表达和转基因生物的鉴定,第八章 外源基因的表达和转基因生物的鉴定,1,第一节 外源基因在受体中的表达,一、,外源基因在受体中表达的一般特征,（一）,原核基因在原核细胞中的表达,转录：需强启动子,翻译：,（1）起始密码子,（2）,SD,序列,（二）,真核基因在真核细胞中的表达,只要外源基因与受体组织具有相同的基因表达系统，就可在宿主细胞中表达，更确切地说，只要外源基因具有真核基因特有的启动子及其它控制序列，则它们就能正常表达。,第一节 外源基因在受体中的表达一、外源基因在受体中表达,2,（三）、真核基因在原核细胞中的表达,存在困难：,原核细胞,RNA,聚合酶不能识别真核基因的启动子。,由于真核基因为不连续基因，因而必须将内含子切除后才能成为成熟的,mRNA,，,但原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。,在原核细胞中，,mRNA,必须含有,SD,序列才能和核糖核蛋白体结合，从而指导蛋白质的合成。而真核基因转录的,mRNA,缺少,SD,序列。,真核基因在原核细胞表达产生的外源蛋白很不稳定，容易被细胞蛋白酶所破坏。,（三）、真核基因在原核细胞中的表达 存在困难：原核细胞RN,3,（四）原核基因在真核细胞中的表达,二、,原核细胞高效表达外源基因,原核基因在真核细胞中的表达主要是表达产物的剂量问题，剂量较少又是因为原核基因组和真核基因组的结构特征有差异，因而有表达障碍。,1、,形成融合蛋白,融合蛋白,N,端：由原核,DNA,序列编码，,C,端：由真核,DNA,的完整序列编码。,（四）原核基因在真核细胞中的表达 二、原核细胞高效表达外源基,4,可以通过两步亲和层析来进行纯化：,2、,外源蛋白的分泌表达,（1）将含有融合蛋白的粗制样品，通过特定的亲和层析柱，使融合蛋白和柱上的配基进行亲和作用而吸附到层析柱上，将杂蛋白洗净后，再将融合蛋白洗脱下来。,（,2,）将纯化的融合蛋白进行化学或酶法裂解后，再上同样的亲和层析柱，此时融合伙伴蛋白或亲和柄吸附到柱上，而流出液则含有纯化的目标蛋白。,外源蛋白可能积累的方式有三种，即出现于细胞质、周质及细胞外培养基中。,（1）存在于细胞质,容易形成包含体，蛋白质已经折叠了，纯化后再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性。,可以通过两步亲和层析来进行纯化： 2、外源蛋白的分泌表达 （,5,外源蛋白在大肠杆菌的分泌表达的四大好处：,（1）可以简化发酵后的纯化工艺。,（2）保证表达的外源蛋白具有正确的天然一级结构。在大肠杆菌中表达的外源蛋白很多都保留有,N,端的,Met，Met,的存在就可能影响到表达蛋白的生物活性或免疫原性。通过基因设计，就可以去除,Met。,（3）,外源蛋白生物活性的高低，依赖于蛋白的正确折叠，而分泌表达设计，有利于正确构象的形成。,（,4,）将外源蛋白分泌到周质或培养基中，就减少了外源蛋白被蛋白水解酶降解的机会，可提高蛋白的回收率。,外源蛋白在大肠杆菌的分泌表达的四大好处：（1）可以简化发酵后,6,(2)存在于周质,（3）存在于胞外,由于周质中蛋白种类少，目标蛋白纯化较为简单；,蛋白酶解程度不甚严重；,促进二硫键的形成及蛋白质的折叠作用；,蛋白质,N-,末端结构真实。,蛋白质酶解作用最低；,目标蛋白容易纯化；,增进了蛋白质的折叠作用；,蛋白质,N-,末端结构真实。,(2)存在于周质（3）存在于胞外由于周质中蛋白种类少，目标蛋,7,3、,通过减轻宿主细胞的代谢负荷,（,1,）基因产物的诱导表达,该方法是当宿主细胞大量生长时，抑制外源基因的表达；而当宿主细胞的生物量达到饱和时，再诱导外源基因的表达。,例：,温度敏感的转录调控蛋白,cI857,（2）,表达载体的诱导复制,该方法是在宿主细胞大量生长时，抑制重组质粒的复制；而当细胞生物量积累到一定水平时，再诱导细胞中重组,DNA,的复制。,3、通过减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）基因产物的诱导表达,8,带有质粒的大肠杆菌,HB101,质粒拷贝数 相对生长速率/%,无 0 1.00,A 12 0.92,B 24 0.91,C 6 0 0.87,D 122 0.82,E 408 0.77,质粒拷贝数对细胞生长速率的影响,带有质粒的大肠杆菌HB101 质粒拷贝数,9,三、外源基因在植物中的表达,1,、同源性表达和异源性表达,同源性表达（,homologous expression,）,指来源于相同物种的基因（即来源于植物基因）在植物受体细胞中的表达,。,异源性表达（,heterologous expression,）,则指来源于其它物种的基因在植物中的表达。,异源表达困难的原因：是因为不同物种,RNA,聚合酶所识别的启动位点不同，因而造成异源表达困难的结果。,三、外源基因在植物中的表达 1、同源性表达和异源性表达 同源,10,2、,瞬时表达和稳定表达,3、组成型表达和发育特异性表达,稳定表达（,stable expression,）：,转化的外源基因在细胞水平可检测到它的产物，在个体水平也能检测到性状表现，并且可稳定地遗传给后代，这种正常的长期表达称为稳定表达。,瞬时表达（,transient expression,）：,在受体中表达一个细胞周期或一个培养周期，这种表达称瞬时表达。,组成型表达（,constitutive expression,）,指表达是持续的，,RNA,及蛋白质表达量也相对恒定，不受时空条件改变而改变，也不因外界因素变化而诱导基因表达，相当于稳定表达。,2、瞬时表达和稳定表达 3、组成型表达和发育特异性表达 稳定,11,4、,条件诱导表达,（,1,）热诱导表达,某些植物（如大豆、玉米等）暴露在高温下（通常在,35,以上）细胞可在,1,3,小时内合成一些新的蛋白质或增大特异蛋白质的合成量。若将植物放回正常温度下，正常的蛋白质合成可以在30分钟内恢复。,（2）,共生细菌诱导表达,豆血红蛋白是由一组基因编码的，在大豆中现已找到,4,个含有该蛋白质编码序列的连锁区段，其中包括,4,个正常基因（,1,ba,，,lbcl,，,1bc3,）,和,1,个假基因。将大豆血红蛋白,1,bc3,基因的,5,和,3,区段连接到编码,CAT,通告酶的编码序列上，再将此嵌合基因引入到一种异源豆科植物百脉根中，结果在未感染根瘤菌的转基因植株的任何组织中都未检测到表达；但当转基因百脉根植株的根用根瘤菌感染时，在根瘤发育的特定阶段（此时豆血红蛋白被正常诱导）检出了高水平的,CAT,表达。,4、条件诱导表达 （1）热诱导表达 某些植物（如大豆、玉米等,12,第二节,转基因生物的鉴定,一、个体水平鉴定,个体水平上鉴定利用遗传学和育种学方法，即种植或诱导转化体表现其性状特征或生理特征。,二、细胞和组织水平鉴定,报告基因,：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。,一个理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中应不存在相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且应该快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。,第二节 转基因生物的鉴定 一、个体水平鉴定 个体水平上,13,1、,胭脂碱和章鱼碱检测,2、,新霉素磷酸转移酶（,NPT-,）,基因,这两种报告基因在植物的根、茎、叶中均能表达。将植物材料直接挤压在电泳图谱纸上，进行电泳，经电泳胭脂碱和章鱼碱可以同正常组织中含有的精氨酸分开，用敏感的荧光染料菲醌进行染色，即可观察到植物样品中是否含有胭脂碱或章鱼碱，从而判断出转化是否成功。,冠瘿碱（胭脂碱和章鱼碱）菲醌,2,天后呈蓝色,紫外光下呈黄色荧光,它的作用是催化许多氨基酸糖苷类的磷酸化反应，即催化,ATP,上的,-,磷酸转移到诸如新霉素、卡那霉素、庆大霉素和,G418,等抗生素分子的某些基团上。这些抗生素结构类似，都能抑制原核细胞核糖体,70,S,起始复合物的形成，阻碍蛋白质的合成，从而抑制细胞的生长。,1、胭脂碱和章鱼碱检测 2、新霉素磷酸转移酶（NPT-）基,14,3、氯霉素乙酰转移酶（,CAT,）,基因,氯霉素可选择性地与原核细胞核糖体,50,S,亚基结合，抑制肽酰基转移酶的活性，从而阻碍肽键的形成，使蛋白质合成受到抑制，最终抑制植物的生长。而乙酰化的氯霉素就会失去与核糖体,50,S,亚基结合的能力，所以携带有,CAT,基因的转基因植株就具有了对氯霉素的抗性。,CAT,基因是由大肠杆菌易位子,Tn9,所编码的，它可以催化乙酰,CoA,转乙酰基到氯霉素分子的某些基团。,CAT,基因 1乙酰氯霉素,CoA ,氯霉素 2乙酰氯霉素 氯霉素失效,3乙酰氯霉素,缺点：信号没有,NPT-II,强,优点：克服了受体细胞非特异性酶,本底较高的缺点，且,CAT,酶定量分析很准确。,3、氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因 氯霉素可选择性地与原核细,15,4,潮霉素磷酸转移酶（,HPT,）,5,、,-,葡萄糖酸苷酶（,GUS,）,基因,潮霉素的生物学功能是与,70,S,和,80,S,核糖体结合，从而抑制生物蛋白质的合成，最终导致生物生长受到抑制。,HPT,酶能催化,ATP,上的,-,磷酸基因转移至潮霉素分子上，磷酸化的潮霉素就失去了抗生素的抗性，因而携带有,Hpt,基因的转化体就会表现出对潮霉素的抗性。,GUS,基因所编码的,-,葡萄糖酸苷酶可催化裂解人工合成的底物,4-,甲基伞形花酮,-,-D-,葡萄糖苷酸，产生荧光物质,4-,甲基伞形酮，可用荧光光度计进行定量测定。,4潮霉素磷酸转移酶（HPT） 5、-葡萄糖酸苷酶（GUS,16,X-gluc,蓝色物质,(5-溴-4-氯-3-吲哆葡萄糖醛苷酸) （5，5-二溴-4，4-二氯靛蓝）,4-,MUG 4MU（4-,甲基伞形酮）,-D-,葡萄糖醛酸,（4-甲基伞形酮酰-,-D-,葡萄糖醛酸）,荧光物质,GUS,GUS,（1）GUS,基因的检测十分简单、方便和灵敏。,（2）绝大多数植物中没有检测到该酶的背景活性。,（3）GUS,基因还可用来进行嵌合基因的构建和分析。,优点：,X-gluc 蓝色物质荧光,17,6,、荧光素酶（,LUC,）,基因,来源：,从北美荧光虫和叩头虫的,cDNA,文库中克隆出来的,。,功能：,LUC,基因所编码的荧光素酶是生物体催化自身发光的一种蛋白质。该酶在有,ATP,、,Mg,2+,、,O,2,和荧光素存在的条件下可发射出荧光，荧光持续数秒到数分钟即消失，可用微光测定仪检测到非常微弱的荧光素酶分子。,（1）,LUC,测定灵敏度非常高,（2）,LUC,检测法成本低,（3）免于放射性同位素检测对人体健康和生态环境所造成的危害 。,（4）,该酶的活性不需要转录后修饰，无二硫键，不要求辅酶因子和结合金属，因此可以在几乎所有的宿主细胞中表达。,优点：,6、荧光素酶（LUC）基因 来源：从北美荧光虫和叩头虫的cD,18,7,、绿色荧光蛋白（,GFP,）,基因,8、,二氢叶酸还原酶（,DHFR,）,基因,来源：,海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光。,功能：,GFP Cdnad,开放阅读框架长度约,740,bp,，,编码,238,个氨基酸残基，其肽链内部第,65,67,位丝氨酸,-,脱氢酪氨酸,-,甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基团，在长紫外波或蓝光照射下发出绿色荧光。,检测：,可在荧光显微镜或流式细胞仪中直接观察基因的表达。,二氢叶酸,四氢叶酸,DHFR,是某些氨基酸、核苷酸生物合成的前体,7、绿色荧光蛋白（GFP）基因 8、二氢叶酸还原酶（DHFR,19,氨甲喋呤（,MTX,）,和氨基喋呤（,APT,）,是叶酸的类似物，它们能竞争性地与二氢叶酸还原酶结合，从而使之失去活性，最终导致细胞死亡。,氨甲喋呤抗性细胞系，其中一个原因就是,DHFR,基因大量扩增，使,DHFR,在细胞中大量表达。,如果我们将目标基因同可扩增的,DHFR,基因一起转化受体细胞，就可以通过,DHFR,基因的表达选择出含有与,DHFR,基因共扩增的目的基因的细胞。,检测方法：,氨甲喋呤（MTX）和氨基喋呤（APT）是叶酸的类似物，它们能,20,9,、抗除草剂,Basta,（,bar,）,基因,三、分子水平鉴定,除草剂,Basta（,膦丝菌素的商品名），它是,L-,谷氨酸的类似物，能够抑制谷氨酰胺合成酶的活性，从而使植物体的积累大量的氨，最终导致植物死亡。,bar,基因是从链霉菌中分离出来的，具有抗除草剂的功能。,机理：,bar,基因编码的膦丝菌素乙酰转移酶会使得,Basta,部分乙酰化，从而解除了,Basta,的毒性。这样，如果转基因植物中转入了,bar,基因，就会使植株表现出对除草剂,Basta,的抗性。,9、抗除草剂Basta（bar）基因 三、分子水平鉴定 除草,21,