免疫荧光技术与激光扫描共聚焦显微镜课件

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,免疫荧光技术与激光扫描共聚焦显微镜,厦门大学生命科学学院,实验十五 免疫荧光染色观察肿瘤细胞骨架,实验十四 激光扫描共聚焦显微镜在生命科学中的应用,免疫荧光技术与激光扫描共聚焦显微镜厦门大学生命科学学院,1,实验目的与要求,掌握免疫荧光技术的基本原理及其在生命科学中的应用；,掌握激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理及其在生命科学中的应用。,实验目的与要求掌握免疫荧光技术的基本原理及其在生命科学中的应,2,抗原是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应的免疫应答产物即抗体和致敏淋巴细胞在体内或体外发生特异性结合的物质，也称为免疫原。,前一种性能称为免疫原性或抗原性，后一种性能称为反应原性或免疫反应性。,抗原的概念,抗原是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相,3,环境中的大部分生物（包括病原生物）及其产物分子和一些化合物对哺乳动物的免疫系统而言是外源抗原，这些抗原能通过侵染和其它的途径刺激免疫系统，产生以抗体为主的体液免疫应答。,同样用抗原人工免疫实验动物，可以获得含有特异性抗体的血清，称为抗血清。,因血清抗体是多个抗原决定簇刺激不同,B,细胞克隆而产生的抗体，称为多克隆抗体。,一个,B,细胞克隆所分泌的抗体即为单克隆抗体。,抗体的概念,环境中的大部分生物（包括病原生物）及其产物分子和一些化合物对,4,根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。,实验原理：,根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成,5,实验的基本原理,荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,抗原抗体反应：,抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种结合在体外也能发生，这种特性就是许多免疫检测方法的基础。,荧光技术与免疫技术的结合,可,用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。,实验的基本原理 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜,6,激光共聚焦扫描显微镜,Laser confocal scanning microscope, LCSM,激光共聚焦扫描显微镜Laser confocal scann,7,普通荧光显微镜的不足,使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，不仅图像与对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辩率（,=0.61 / NA,）。,但当所观察的荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）,。,普通荧光显微镜的不足使用荧光物质标记细胞中的特定成分或结构，,8,2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理,采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。分光器将荧光直接送到探测器。光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。两者的几何尺寸一致，约100-200,nm；,相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔,。这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。,2. 共聚焦扫描显微镜的成像原理,9,Confocal Principle,Confocal Principle,10,每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是有一定厚度的，又称为光学薄片。由于焦点处的光强远大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深近似为零，沿,Z,轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待观察样品聚焦光斑处二维的光学切片。把,X-Y,平面（焦平面）扫描与,Z,轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。,每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横短面总是,11,观察方式：以荧光为主,光源：激光（紫外、可见光、近红外）,照明方式：点照明、逐点扫描,成像方式：共聚焦、逐点成像,输出：实时观测,数字化图像，可以进行图像处理和定量分析,多重染色样品的观察,高分辨率,普通显微镜 0.61,/NA,共聚焦显微镜 0.55,/NA,LSCM,的基本特点,观察方式：以荧光为主LSCM的基本特点,12,3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用,细胞结构、蛋白质（如受体、抗原、抗体、酶、细胞骨架蛋白等基因表达产物）、,DNA、RNA,等,细胞膜流动性（荧光光漂白恢复技术）,细胞内钙离子浓度变化,3. 共聚焦扫描显微镜在生命科学研究中的应用,13,免疫荧光技术与激光扫描共聚焦显微镜课件,14,双重染色标本的单色和双色观察,双重染色标本的单色和双色观察,15,(August 18, 1920 October 4, 1951),第一个在体外连续培养成功的细胞,Henrietta Lacks,(August 18, 1920 October 4,16,一抗：小鼠抗人,-,Tubulin,单克隆抗体，用时已稀释了,200,倍。,二抗：兔抗小鼠免疫球蛋白（,Alexa 488,标记或,FITC,标记），用时已稀释了,200,倍,一抗稀释液：,1ml PBS,中加入,0.02 g,牛血清白蛋白（,BSA）,粉末，溶解后加入,20Tween-20,母液,25,50L,（终浓度,0.05%,0.1,）。,二抗稀释液：配法同一抗。,抗体准备,一抗：小鼠抗人-Tubulin单克隆抗体，用时已稀释了20,17,实验步骤,镊子,取长有,人宫颈癌上皮细胞 （,HeLa,）,细胞的载玻片，冷丙酮4,0,C,固定10,min;,PBS,中漂洗；,多聚甲醛固定液中室温固定,20 min,；,于含,0.1%TritonX-100,的,PBS,中室温透化,10 min,;,(,长有细胞的一面朝上,),PBS,中漂洗,2,次，每次,5min,。,培养皿中垫上,PBS,浸透过的滤纸，将盖玻片平放在滤纸上，滤纸上吸至半干，,滴加,100,ul,10%羊血清（,PBS+,2,BSA,配制）,室温封闭,10,min,;,倾去羊血清封闭液，滴加,30 ul,一抗（一般稀释比为1:200）,至细胞表面,，,恒温箱中,湿盒内37,0,C,孵育,60 min,;,PBS,漂洗3次，每次,5 min,;,滴加荧光染料,Alexa 488,标记的二抗（一般稀释比为,1:200,）,50 ul,，室温孵育,30 min,（避光黑暗条件下进行）,;,PBS,漂洗,3,次，每次,3 min,;,Hoechst 33258,染色,5,min,，,PBS,漂洗,1 min,；,滤纸上吸干玻片上残余的液体，在干净载玻片上滴,一,小滴（,10-20 ul),甘油/,PBS,封片剂(,pH8.5，PBS:,甘油=1:9，,v/v),封固剂，,细胞面朝下盖于封固剂上,，在载玻片上贴好，赶走气泡,;,指甲油将盖玻片四周封好,（本次实验不用该步骤）,；,荧光显微镜（或激光扫描共聚焦显微镜）观察（或,避光保存待观察）,。,实验步骤,18,预实验结果,DAPI,染色,DAPI-FITC,染色,注意事项,:,1.,荧光抗体孵育时要注意避光,;2.,注意各步骤的漂洗要充分。,预实验结果DAPI 染色 DAPI-FITC 染色 注意事项,19,作业,:,试述免疫荧光技术的基本原理,并描述实验中所观察的实验现象。,作业:试述免疫荧光技术的基本原理, 并描述实验中所观察的实,20,